【摘要】：第一部分白楊素抑制炎癥狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)目的目前發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮炎癥的發(fā)生與多種血管疾病如動脈粥樣硬化、血栓閉塞性脈管炎、糖尿病血管病變等等密切相關(guān)。黃酮類化合物被證明能有效預(yù)防動脈硬化、降低血脂和膽固醇、及減少冠心病發(fā)病率等。然而黃酮類化合物在內(nèi)皮炎癥方面的研究較少被提及。本實驗旨在探究一種黃酮類化合物即白楊素(Chrysin)對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響及對粘附分子的表達(dá)。方法將原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與極低、低、中、高四種濃度的白楊素共同孵育6小時后,予以內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞介素1β(IL-1β)刺激以模擬內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型。通過細(xì)胞粘附實驗來檢測給藥與否及不同濃度對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞(THP-1)粘附率的影響,以及對細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇素(E-selectin)的信使RNA水平及蛋白表達(dá)水平的影響,據(jù)此評價白楊素對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的作用。結(jié)果白楊素可以有效地降低炎癥狀態(tài)下的HUVEC與THP-1的粘附率,并且呈濃度依賴性地抑制IL-lβ誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的mRNA水平和ICAM-1和VCAM-1蛋白水平的增加。結(jié)論在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥狀態(tài)下,白楊素可以有效地抑制原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的粘附作用,且抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯,以減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生。第二部分白楊素通過NF-κB途徑影響粘附分子的表達(dá)目的前一部分的實驗證明了白楊素對內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥有明顯的呈濃度依賴性的抑制作用,據(jù)已有研究報道,核因子κB(NF-κB)在內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中十分重要,尤其是在調(diào)節(jié)粘附分子的作用中,下面我們對白楊素抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的分子機制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。方法不同濃度的白楊素孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,再予以白細(xì)胞介素1β刺激,通過western-blot檢測NF-κB通路中核因子κB的亞基p65及核因子κB抑制因子A(IκBα的經(jīng)磷酸化修飾過的蛋白表達(dá)量變化及總蛋白表達(dá)量變化,通過p65免疫熒光染色檢測p65在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位,將處理后的HUVEC細(xì)胞核質(zhì)分離后,通過western-blot檢測胞質(zhì)胞核中p65及IκBα的表達(dá)量。不同濃度的白楊素孵育人腎上皮細(xì)胞系(HEK-293T)后,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測ICAM-1、VCAM-1以及E-selectin的啟動子活性的影響。結(jié)果HUVEC在不同濃度白楊素的處理下,p-65及p-IκBα均呈濃度依賴性的減少,總p65表達(dá)量保持不變,而總IκBα表達(dá)量首先因IL-1β的作用降低,而后呈白楊素濃度依賴性地增加。中、高濃度白楊素孵育后,通過免疫熒光檢測到HUVEC細(xì)胞質(zhì)中的p65增加,而核內(nèi)p65減少;對細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離后提取蛋白,檢測到細(xì)胞質(zhì)中的p65中濃度時稍增加,于高濃度時減少,而胞核內(nèi)p65明顯地呈濃度依賴性減少。白楊素孵育后的293T細(xì)胞中ICAM-1及VCAM-1的啟動子活性明顯被濃度依賴性地抑制,E-selectin僅有下降趨勢。結(jié)論在內(nèi)皮細(xì)胞中,白楊素抑制了IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活,且同時抑制核因子κB入核,增加了IκBα的降解。白楊素能明顯降低ICAM-1和VCAM-1的啟動子轉(zhuǎn)錄活性,削弱E-selectin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。第三部分白楊素減輕小鼠全身性炎癥損傷模型中的炎癥反應(yīng)目的探討白楊素在小鼠體內(nèi)中對血管炎癥反應(yīng)的影響。方法將白楊素配成低劑量及高劑量兩種濃度,給小鼠連續(xù)灌胃白楊素及陽性對照藥物7天后予以小鼠腹腔注射脂多糖(LPS),18小時后處死小鼠并獲取小鼠肺、肝臟及腎臟,進(jìn)行組織切片及HE染色,觀察切片中血管管腔及管周的白細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞聚集及間質(zhì)水腫等情況。結(jié)果經(jīng)白楊素預(yù)處理的小鼠血管損傷如白細(xì)胞浸潤,紅細(xì)胞聚集和間質(zhì)水腫呈濃度依賴性地減輕。結(jié)論白楊素減輕了白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附和炎癥,對內(nèi)皮損傷的滲透性和炎癥反應(yīng)具有抑制作用,并且需要進(jìn)一步研究白楊素的潛在用途,例如在糖尿病性血管病或動脈粥樣硬化等疾病中的作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2741404