【摘要】：目的:探究白花蛇舌草對炎癥的治療作用;初步探討白花蛇舌草在固有免疫方面可能的抗炎作用機制,為臨床治療提供實驗依據(jù);對白花蛇舌草中已知microRNA(miRNA)進行鑒定與分析,并預(yù)測所含新miRNA,為后續(xù)蛇舌草miRNA及靶基因調(diào)控表達在抗炎機制方面的研究提供依據(jù)。方法:用二甲苯致小鼠耳腫脹模型。選昆明種小鼠隨機分成空白組、陽性對照組(阿司匹林),白花蛇舌草水提物低、中、高劑量組,白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組共8組。連續(xù)灌胃7d,末次給藥1h后,在小鼠右耳兩面涂以100%二甲苯30微升,左耳對照,30min后處死,沿耳郭基線剪下左右耳,用打孔器(半徑4mm)制備耳片,以兩耳重量差作為炎癥指標,研究白花蛇舌草的抗炎作用。選用SD大鼠,隨機分成模型組、陽性對照組(阿司匹林),白花蛇舌草水提物低、中、高劑量組,白花蛇舌草醇提物低、中、高劑量組共8組,保證無菌條件,水合氯醛麻醉后作腹部切口,將已稱重的棉球植入大鼠兩腹溝股部皮下。受試藥物當天給予,連續(xù)12d,最后一次給藥1h后將大鼠處死,完整剝離棉球肉芽組織,于75℃烘箱內(nèi)干燥24h后稱重,減去原棉球重量,即為肉芽腫凈重。比較各組肉芽重量,計算抑制率。先應(yīng)用“寇氏法”進行LD_(50)測定~([1]),然后建立小鼠膿毒癥模型:模型組小鼠稱重后,腹腔注射LD_(50)劑量LPS(0.2ml/10g),陰性對照組和中藥對照組給予等量生理鹽水。將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、地塞米松干預(yù)組和白花蛇舌草水提組、醇提組。地塞米松干預(yù)組、水提組、醇提組連續(xù)灌胃7d,其余各組給予等體積生理鹽水;末次給藥30min后,除空白組外,其余各組小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)造模,空白組給予等體積生理鹽水,1次/d持續(xù)至實驗結(jié)束。分別于造模后6h、12h、24h、48h進行臨床癥候觀察,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清炎癥因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。頸椎脫臼法處死小鼠,觀察各組織病理變化,并統(tǒng)一切取肝左上葉,置于10%中性福爾馬林溶液中固定后,制成5μm厚的石蠟切片,光鏡下觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)變化。Trizol法提取白花蛇舌草總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、TGem微量分光光度計及Agient 2100 Bioanalyzer檢測總RNA純度及完整性。然后構(gòu)建白花蛇色草smallRNA文庫,以Unigene為參考序列,將獲得的Clean read與Gene、Rfam、miRNABase21.0以及Repbase數(shù)據(jù)庫比對,得到已知miRNA及其表達量,未比對上的序列用于新miRNA的預(yù)測分析。結(jié)果:耳腫脹實驗結(jié)果顯示,白花蛇舌草水提物、乙醇提取物均對二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用。其中水提取物高劑量組,醇提物低劑量組和中劑量組抑制效果明顯。肉芽腫實驗結(jié)果顯示,白花蛇舌草水提中、高劑量組,醇提低、中劑量組對大鼠棉球所致肉芽腫有明顯的抑制作用。LPS膿毒癥實驗結(jié)果顯示,白花蛇舌草提取物組小鼠肝臟組織損傷程度明顯輕于模型組,并且水提組損傷減輕更明顯;與同時間節(jié)點模型組比較,白花蛇舌草水提組和白花蛇舌草醇提組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P0.05)。組內(nèi)比較,白花蛇舌草提取物組12h節(jié)點對上述指標的改善均明顯優(yōu)于6h節(jié)點,并且與白花蛇舌草醇提取物組相比,白花蛇舌草水提取物組各時間節(jié)點作用效果較好,但無顯著性差異。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,白花蛇舌草總RNA的18S、28S條帶清晰完整,亮度比值接近2;Agient 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢結(jié)果顯示OD_(260nm)/OD_(230nm)值處于1.8-2.1,OD_(260nm)/OD_(280nm)值處于2.0-2.3,28S/18S1.0,RIN7.0,滿足RNA高通量建庫標準。通過高通量測序,最終鑒定出白花蛇舌草中含115個已知miRNA,分屬于16個miRNA家族。表達豐度最高的miR166、miR157、miR2911、miR167、miR168等miRNA家族的表達量均超過50000。結(jié)論:白花蛇舌草提取物能有效抑制小鼠耳腫脹、大鼠棉球所致肉芽腫,其中水提物濃度為3g/kg時抑制作用最為明顯;醇提物濃度為125mg/kg時抑制作用最為明顯。白花蛇舌草提取物能夠有效改善LPS膿毒癥小鼠的肝損傷,減輕小鼠的臨床癥狀;能有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α水平,其作用機制可能是通過抑制此相關(guān)炎癥因子的表達,調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)的平衡而發(fā)揮作用。成功提取了符合高通量測序的白花蛇舌草總RNA及構(gòu)建smallRNA文庫,鑒定白花蛇舌草所含microRNA的種類及表達量,證實新鮮白花蛇舌草中富含microRNA。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 4-1 各組小鼠肝組織病理變化（HE 染色，×200）ig. 4-1 Pathological changes of liver tissue in each group (HE staining, ×200)肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排脹、變性或壞死。模型組小鼠肝細胞可見明顯腫脹、變性，排列紊細胞邊界及細胞核模糊不清，有炎性細胞浸潤，肝細胞脂肪樣變性，胞凋亡，24h 后，病變情況逐漸好轉(zhuǎn)。白花蛇舌草提取物組和陽性模型組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，少數(shù)肝細胞有輕微水腫，其異常變化（見圖 4-1）。的觸發(fā)劑，其后有多參與 SIRS 的最初啟動，其中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 為最有影同時機體產(chǎn)生的內(nèi)源性免疫炎性因子會形成“瀑布效應(yīng)”，危重病人性抗炎反應(yīng)能力降低以及代謝功能紊亂，最易引發(fā) SIRS，嚴重者可

圖 5-2 各組小鼠血清中炎癥因子 IL-6 水平含量Figure 5-2 Serum levels of inflammatory cytokines IL-6 in each group of mice 白花蛇舌草提取物對膿毒癥模型小鼠血清中 IL-1β 水平的影響.1 IL-1β 標準品濃度曲線的建立

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