發(fā)布時間：2020-06-30 10:55

【摘要】：近年來,心腦血管疾病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢,其防治工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性血管炎癥性疾病,是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。免疫學(xué)說認(rèn)為巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜的遷移是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié),如果能抑制巨噬細(xì)胞向受損血管遷移,就能夠在對其免疫功能影響較小的情況下,實現(xiàn)AS的早期防治。中藥水蛭具有抗凝血、抗血栓和抗炎癥等多種活性,臨床上已被廣泛應(yīng)用于治療多種心腦血管疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)水蛭酶解物(Hirudo Extraction,HE)可以顯著性降低ApoE-/-小鼠主動脈AS斑塊面積及斑塊中巨噬細(xì)胞的數(shù)量,其作用機制可能與抑制巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜下層遷移有關(guān),因此,本課題在上述研究的基礎(chǔ)上計劃從HE中分離純化出具有抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移活性的多肽,并對其作用機制進(jìn)行研究。主要實驗內(nèi)容及結(jié)果如下:1.抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移水蛭肽的分離純化與合成本實驗采用酶解法從寬體金線蛭中制備得到水蛭酶解物HE。在建立LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移模型后,通過Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn)HE可以濃度依賴性抑制巨噬細(xì)胞遷移。接著使用Q Sepharose FF強堿性陰離子交換柱層析、Superdex 30、Superdex peptide和G10凝膠柱層析對HE進(jìn)行分離純化,并結(jié)合Transwell實驗進(jìn)行活性追蹤,最終分離得到具有抑制巨噬細(xì)胞RA3W264.7遷移活性的水蛭肽HE4-1。經(jīng)HPLC和高分辨質(zhì)譜檢測,水蛭肽HE4-1純度為98%,分子量為1429.294 Da,氨基酸序列為EAGSAKELEGDPVAG。Transwell實驗結(jié)果顯示800 μg/mL合成水蛭肽HE-D同樣具有抑制巨噬細(xì)胞遷移活性。2.水蛭肽抑制巨噬細(xì)胞遷移作用機制研究研究顯示JNK和p38通路參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移。本實驗通過Western blot探究HE-D對巨噬細(xì)胞JNK和p38蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示HE-D對JNK與p38總蛋白的表達(dá)量無顯著影響,但800 μg/mL的HE-D可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的JNK和p38磷酸化蛋白的升高,這表明HE-D可以通過調(diào)節(jié)JNK和p38磷酸化水平發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞遷移作用。3.水蛭肽對巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能影響探究巨噬細(xì)胞是機體免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞。當(dāng)外源性微生物入侵機體后,巨噬細(xì)胞可以通過吞噬、溶解細(xì)菌和釋放促炎因子調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)。本課題通過中性紅吞噬實驗、溶菌酶活性測定實驗和ELISA實驗檢測水蛭肽對巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示0-800 μg/mL的HE4-1和HE-D對巨噬細(xì)胞吞噬能力、溶菌酶活性和對IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力無顯著性影響,但400、800 μg/mL的HE4-1和HE-D可以促進(jìn)TNF-α的分泌。綜上所述,本課題首次從寬體金線蛭干體中分離純化得到一段序列為EAGSAKELEGDPVAG的多肽HE4-1,該多肽可通過抑制MAPK通路中JNK和p38磷酸化水平發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移作用。此外,純化和合成水蛭肽均對巨噬細(xì)胞吞噬能力、溶菌酶活性和IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力無顯著性影響。本課題有可能為中藥水蛭在AS早期防治上的應(yīng)用提供新的理論支持。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

如本章２．邋１．３．２。逡逑物的制備及抑制巨噬細(xì)胞遷移活性檢測逡逑備逡逑法從１００邋ｇ寬體金線蛭干體粉末中提取得到水蛭酶Ｅ。逡逑毒性檢測逡逑法檢測ＨＥ在０－８００邋ｐｇ／ｍＬ范圍內(nèi)對巨噬細(xì)胞ＲＡ顯示在該濃度范圍內(nèi)，ＨＥ對巨噬細(xì)胞的存活率無ＨＥ濃度確定為０＿８０（Ｈｉｇ／ｍＬ。逡逑

３．邋１．３邋ＨＥ抑制巨噬細(xì)胞遷移活性檢測逡逑３．邋１．３．邋１邋ＬＰＳ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．７遷移模型的建立逡逑使用ＬＰＳ誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．邋７徖移模型。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ結(jié)果如圖２－２逡逑所示，１邋ｐｇ／ｍＬＬＰＳ可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．７的遷移，且遷移細(xì)胞數(shù)量逡逑適中，便于計數(shù)，因此選擇該濃度作為ＬＰＳ的最終造模濃度。逡逑：．、，tj＿邐Ｂ逡逑．＇Ｖ邋Ｖ邋：／邐１５０００－，逡逑焌：：媭海Ｉ廔輯詹§邐￡邐＊＊逡逑．ｊ

本文編號：2735224