【摘要】：動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是多種細胞參與的動脈血管的慢性炎癥性疾病。血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)的炎癥損傷是AS形成的始動環(huán)節(jié)和關鍵因素,會繼發(fā)炎癥因子、粘附分子的異常分泌、免疫細胞粘附、浸潤等事件。細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是AS感染的主要誘因,可激活先天免疫,進而導致VECs損傷。外泌體作為細胞釋放的細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一個亞群,可促進多肽、microRNAs(miRNAs,miRs)在細胞和組織之間交換。單核/巨噬細胞(Monocyte/macrophage,M/MΦ)來源的外泌體(M/MΦ-exo)包含豐富的具有抗炎作用的miR-223,miR-223可能通過調(diào)控其下游STAT3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)等炎癥靶基因延緩AS的發(fā)生發(fā)展。因此,miR-223作為STAT3上游的調(diào)控因子,將可能是治療AS的一個新型治療靶點。丹皮酚(paeonol,Pae)是從是中藥植物牡丹的干燥根皮中提取純化得到的主要活性成分之一,具有抗炎、降血脂、活血化瘀等廣泛藥理作用。我們前期的研究已證實Pae對損傷的VECs具有一定保護作用,然而該保護作用是否與Pae通過調(diào)控M/MΦ釋放的外泌體miR-223水平有關尚需進一步探究。首先在體內(nèi)實驗中,我們在高脂喂養(yǎng)ApoE~(-/-)小鼠中觀察Pae的治療作用以及對小鼠主動脈中VECs中STAT3通路和miR-223表達的影響。在體外實驗中,以LPS作為炎癥誘導因子,激活THP-1細胞,觀察LPS刺激的THP-1細胞外泌體在共培養(yǎng)條件下以及單獨提取外泌體后對共孵育的HUVEC的影響。從基因水平闡明Pae調(diào)控的單核細胞外泌體對VECs炎癥反應的作用,為Pae應用于治療AS提供新靶點和科學依據(jù)。目的探討Pae對STAT3通路介導AS小鼠炎癥以及和miR-223的表達情況,Pae對LPS刺激的單核細胞外泌體miR-223的表達差異及其在VECs中對靶蛋白STAT3的負調(diào)控作用,為揭示單核外泌體為潛在靶點的抗AS藥物防治提供新的思路。方法高脂飲食喂養(yǎng)ApoE~(-/-)小鼠復制AS模型;HE染色法觀察小鼠主動脈病變;ELISA法檢測IL-1β、IL-6的表達;Western blot法檢測STAT3、pSTAT3、ICAM-1、VCAM-1的表達;免疫組織化學法檢測各組主動脈CD68、p-STAT3的表達;qPCR檢測miR-223的表達;建立THP-1/HUVEC共培養(yǎng)體系;透射電鏡觀察外泌體形態(tài);DLS和NTA檢測外泌體電位和粒徑分布,Western blot法檢測外泌體標志蛋白,采用激光共聚顯微鏡觀察HUVEC對外泌體攝取;流式細胞儀檢測攝取率;雙熒光素酶基因報告實驗對miR-223靶基因的驗證。結(jié)果1 Pae抑制ApoE~(-/-)小鼠斑塊形成以及炎癥介質(zhì)的表達我們建立了高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE~(-/-)小鼠AS模型,Pae可減輕AS病變明顯,減小斑塊的面積顯著;降低ApoE~(-/-)小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6的水平;降低ApoE~(-/-)小鼠主動脈粘附分子ICAM-1、VCAM-1的水平;抑制ApoE~(-/-)小鼠主動脈M/MΦ的粘附浸潤以及主動脈pSTAT3的表達;Pae可顯著升高ApoE~(-/-)小鼠主動脈miR-223的含量。2 Pae抑制與LPS刺激的THP-1細胞共培養(yǎng)的HUVEC炎癥反應Pae(24h,60μM)可以LPS抑制刺激的THP-1細胞的活力;升高LPS刺激的THP-1中miR-223的表達。之后我們建立THP-1與HUVEC的共培養(yǎng)體系,我們發(fā)現(xiàn)THP-1中miR-223的含量遠遠高于HUVEC,且在共培養(yǎng)體系中可將miR-223傳遞給HUVEC;Pae升高與LPS刺激的THP-1細胞共培養(yǎng)的HUVEC中miR-223的表達;而Pae,外泌體分泌抑制劑GW4869,外泌體攝取抑制劑Heparin均會降低LPS刺激細胞共培養(yǎng)體系HUVEC中IL-1β、IL-6、VCAM-1、ICAM-1的水平的升高。3 Pae對外泌體的生物學形態(tài)影響為驗證外泌體的功能,我們用超濾離心法提取不同情況下的外泌體,用多種方法對外泌體進行表征,透射電鏡觀察到各組外泌體具有明顯的具有茶托樣膜結(jié)構;Western blot檢測外泌體標志蛋白CD63、CD9、LAMP2、CD54、Alix、TSG101、HSP70的表達量明顯高于各THP-1細胞組,而陰性對照Calnexin則不在外泌體中表達;納米粒子示蹤分析儀(NTA)與納米激光粒度分析儀(DLS)表明各組外泌體整體顆粒峰值在105 nm左右,電位值在-10左右,各組無顯著差異。4 Pae通過外泌體緩解對HUVEC炎癥反應為排除Pae預處理THP-1細胞來源的外泌體含有的Pae對下游實驗的干擾,我們用HPLC法檢測不同濃度Pae處理下外泌體中Pae的含量,我們發(fā)現(xiàn)外泌體中Pae的含量隨Pae處理濃度的升高而升高;外泌體中微量的Pae(0.5,2,8 nM)對HUVEC活力沒有影響,且對LPS-exo刺激的HUVEC活力沒有治療作用,Con-exo并不影響HUVE活力,LPS-exo可以呈濃度梯度顯著降低HUVEC細胞活力,而各組Pae-exo對HUVEC活力的抑制并不明顯;攝取外泌體后升高HUVEC中miR-223的表達;Pae-exo與LPS-exo比,可升高HUVEC中miR-223的水平;Pae-exo與LPS-exo比,可降低HUVEC中IL-1β、IL-6、ICAM-1、VCAM-1的水平及HUVEC對THP-1細胞的粘附;可降低HUVEC中STAT3,pSTAT3的水平。5 Pae通過升高THP-1源性外泌體miR-223抑制HUVEC的STAT3通路雙熒光素酶基因報告實驗驗證miR-223靶基因為STAT3 mRNA,轉(zhuǎn)染miR-223 mimic后,可以升高泌體和攝取外泌體后的HUVEC中miR-223的含量,降低STAT3和p-STAT3的表達,抑制IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的水平及HUVEC對THP-1細胞的粘附。而miR-223 inhibitor可以逆轉(zhuǎn)Pae的作用,升高STAT3和p-STAT3的表達,提高IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的水平及HUVEC對THP-1細胞的粘附。結(jié)論1.Pae抗ApoE-/-小鼠AS的機制可能與抑制STAT3炎癥通路極其下游IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的表達,單核細胞粘附有關。2.Pae可以升高單核細胞外泌體miR-223的含量,可以升高攝取外泌體后的HUVEC中miR-223的含量,降低STST3,p-STAT3的表達,抑制HUVEC中IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的表達,降低單核細胞粘附;而miR-223 inhibitor可以逆轉(zhuǎn)Pae的作用。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

皮酚通過升高單核細胞來源的外泌體 miR-223 抑制 STAT3 介導的內(nèi)皮細胞炎癥反應實驗首先在體內(nèi)實驗中，我們在高脂飲食的 ApoE-/-小鼠中觀察丹皮酚的以及對小鼠主動脈中 VECs 中 STAT3 通路和 miR-223 表達的影響。在體，以 LPS 作為炎癥誘導因子，激活單核細胞，觀察 LPS 誘導的單核細胞共培養(yǎng)條件下以及單獨提取外泌體后與 VECs 共孵育后，VECs 中 miR-2以及 STAT3 介導的炎癥通路的激活，通過轉(zhuǎn)染 miR-223 mimic 或 inhibitmiR-223 過表達或低表達的外泌體對 STAT3 的調(diào)控，及 Pae 對 LPS 誘導胞外泌體中 miR-223 的影響，從基因水平闡明單核細胞外泌體在 VECs的作用及 Pae 的調(diào)控作用的科學依據(jù)，為 Pae 應用于治療 AS 提供新靶流程見附錄）。

lls/mL )懸液接種于 96 孔板中（25、50、100、200、400μg/m量為藥物含量對照（0.5、2、量 Pae 的對照組，每個濃度、48 h 后每孔加入 10 μL CCK A 值。按下式計算細胞的存 FBS（Exo-free FBS）的 Kda 的超濾離心管中 500mL 每管 10mL，配平后 120000g，將新獲得的分裝，與濃縮上 Fig 2）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 胡國文;李青;牛鑫;胡斌;劉鵑;沈曉黎;汪泱;鄧志鋒;;旋轉(zhuǎn)超濾:一種提取細胞外泌體的新方法[J];第二軍醫(yī)大學學報;2014年06期

2 蘇祥飛;戴敏;;動脈粥樣硬化從毒論治述評[J];安徽中醫(yī)學院學報;2013年02期

本文編號：2719740