【摘要】：目的:本研究選取云南省名中醫(yī)李慶生教授臨床治療經(jīng)驗方“益肺散結(jié)方”中具有逐瘀作用的莪術(shù)、三七,觀察其主要活性成分莪術(shù)醇、姜黃素、三七總皂苷干預(yù)小鼠肺纖維化的作用及機(jī)理,探討其能否緩解肺纖維化,及是否通過抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路增強(qiáng)肺組織細(xì)胞自噬水平來干預(yù)肺纖維化,為臨床防治該疾病提供了新的思路。方法:1.復(fù)制小鼠肺纖維化的模型及分組:采用博來霉素霧化的方法復(fù)制小鼠肺纖維化的模型,每天1次,造模時間共7天,本實驗分為空白組、模型組、益散組分(益肺散結(jié)方部分組分)干預(yù)組、吡非尼酮組、抑制劑組;2.制備藥物及藥物干預(yù):按照益肺散結(jié)方中莪術(shù)醇、姜黃素、三七總皂苷比例制備益肺散結(jié)方部分組分預(yù)混液,益散組分干預(yù)組、抑制劑組給予益肺散結(jié)方部分組分預(yù)混液灌胃;吡非尼酮組給予吡非尼酮灌胃;抑制劑組給予預(yù)混液同時再給予氯喹灌胃;空白組和模型組以等量的無菌水灌胃。模型復(fù)制成功后進(jìn)行灌胃,每天1次,連續(xù)28天。3.指標(biāo)觀測:通過HE、Masson染色觀察小鼠肺組織病理改變;肺組織羥脯氨酸檢測肺組織膠原含量;通過Q-PCR檢測致纖維化相關(guān)因子TGF-β1、α-SMA、Collagen-Ⅲm RNA相對表達(dá)水平;通過電鏡觀察電鏡下自噬小體數(shù)量;通過Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)水平以及PI3K/AKT/m TOR信號通路p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.姜黃素、莪術(shù)醇、三七總皂苷緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化1.1肺組織病理切片結(jié)果模型組可見肺泡間隔明顯增厚,部分可見肺泡壁斷裂,肺泡融合,且可見炎細(xì)胞浸潤,肺血管壁,支氣管壁周圍可見束狀或片狀膠原纖維沉積,肺泡間隔可見明顯膠原纖維沉積;益散組分干預(yù)組可見肺泡間隔增厚,肺泡壁斷裂、融合情況有所改善,氣管、血管以及肺間質(zhì)膠原纖維沉積情況明顯減輕。1.2膠原蛋白檢測結(jié)果模型組小鼠肺組織中羥脯胺酸含量、Collagen-Ⅲm RNA相對表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,給藥28天后,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中羥脯胺酸、Collagen-Ⅲm RNA相對表達(dá)與模型組比較有所下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。1.3致纖維化相關(guān)因子TGF-β1、α-SMAm RNA相對表達(dá)水平模型組小鼠肺組織中TGF-β1、α-SMAm RNA相對表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中TGF-β1、α-SMAm RNA相對表達(dá)有所下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與抑制劑組相比,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中TGF-β1、α-SMAm RNA相對表達(dá)有所下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.姜黃素、莪術(shù)醇、三七總皂苷增強(qiáng)肺組織細(xì)胞自噬水平2.1電鏡觀察自噬小體結(jié)果模型組小鼠肺組織中自噬小體數(shù)量明顯減少;與模型組比較,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中自噬小體數(shù)量顯著增多。2.2自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)模型組小鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1表達(dá)較空白組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中LC3B-Ⅱ、Beclin1表達(dá)有所升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3.氯喹抑制自噬后致纖維化相關(guān)因子表達(dá)上升抑制自噬后,與益散組分干預(yù)組比較,益肺散結(jié)方部分組分+抑制劑組可見炎性浸潤明顯增加,肺泡間隔增寬,部分可見肺泡壁斷裂及肺泡融合,氣管和肺間質(zhì)周圍膠原纖維沉積明顯增加;益肺散結(jié)方部分組分+抑制劑組小鼠肺組織中羥脯胺酸、Collagen-3m RNA相對表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);益肺散結(jié)方部分組分+抑制劑組小鼠肺組織中TGF-β1、α-SMAm RNA相對表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.姜黃素、莪術(shù)醇、三七總皂苷抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路調(diào)控自噬水平模型組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白表達(dá)較空白組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白表達(dá)有所降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);同時益散組分干預(yù)組小鼠肺組織中自噬小體數(shù)量顯著增多,LC3B-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)的影響含量有所上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);結(jié)論:1.益肺散結(jié)方部分組分莪術(shù)醇、姜黃素、三七總皂苷下調(diào)致纖維化相關(guān)因子TGF-β1、α-SMA、Collagen-Ⅲ的表達(dá),降低了細(xì)胞外基質(zhì)以及膠原纖維沉積,緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。2.益肺散結(jié)方部分組分莪術(shù)醇、姜黃素、三七總皂苷促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1的表達(dá),抑制了PI3K/AKT/m TOR信號通路,可能是緩解肺纖維化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2707801