【摘要】：目的:明確陳皮堿性提取物(CAE)對肺纖維化小鼠的干預(yù)作用,并探討其對肺纖維化小鼠原代肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。方法:1.將42只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CAE高劑量組(64mg/kg)、CAE中劑量組(32mg/kg)、CAE低劑量組(16mg/kg)、強(qiáng)的松組(6mg/kg)和吡菲尼酮組(100mg/kg)。除正常組外,其余各組小鼠均通過一次性氣管內(nèi)滴注博來霉素的方法建立肺纖維化模型,造模后第1天開始灌胃小鼠,正常組和模型組按100mg/kg生理鹽水灌胃,其余各組按照相應(yīng)的藥物劑量灌胃,每天灌胃一次,連續(xù)灌胃28天后處死小鼠。記錄小鼠體重變化;肺組織分別行HE染色、Masson染色,并計算肺泡炎和肺纖維化積分;ELISA法檢測肺組織羥脯胺酸(HYP)、前列腺素E2(PGE2)、血清和肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞介素-17(IL-17)含量;免疫組化法測肺組織中膠原蛋白Ⅰ(collagenI)、膠原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)、肺表面活性物質(zhì)C前體(Pro-SPC)蛋白表達(dá);免疫熒光法檢測肺組織中Vimentin表達(dá);TUNEL染色法檢測肺組織凋亡。2.提取正常小鼠及模型小鼠的原代肺成纖維細(xì)胞,通過免疫組化方法檢測Vimentin、α-SMA的表達(dá);用四氮唑鹽比色法(MTT法)檢測CAE對肺成纖維細(xì)胞的抑制作用并計算其IC50;用乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測CAE對肺成纖維細(xì)胞的毒性;通過流式細(xì)胞儀及熒光染色方法檢測CAE對肺成纖維細(xì)胞的凋亡作用;采用Western Blot方法檢測Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase8、Fas、Fas配體(FasL)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、前列腺素受體2(EP2)、磷酸化的p38(p-p38)等蛋白的表達(dá);用氧化應(yīng)激檢測試劑盒檢測CAE對肺成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用水平。結(jié)果:1.與正常組相比,模型組小鼠的肺泡炎和肺纖維化積分明顯升高,而當(dāng)給與不同劑量的CAE后肺泡炎和肺纖維化積分均有不同程度的降低(P0.05或P0.0.1)。2.與正常組相比,模型組小鼠肺組織中collagenⅠ、collagenⅢ、HYP的表達(dá)明顯增加(P0.01),而當(dāng)給與不同劑量的CAE后三者均有不同程度的降低(P0.05或P0.01)。提示CAE可抑制肺纖維化進(jìn)程中的膠原沉積。3.與模型組相比,CAE中劑量組、CAE高劑量組小鼠肺組織中PGE2含量顯著增加(P0.01);同時當(dāng)給與CAE后可使肺纖維化小鼠血清和BALF中IL-17水平顯著降低(P0.05 或 P0.01)。4.CAE干預(yù)后可使肺纖維化小鼠肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)記物Pro-SPC表達(dá)增加,肺成纖維細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin表達(dá)降低(P0.05或P0.01)。5.與正常組小鼠相比,模型組小鼠凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.01);而與模型組比較,CAE高劑量組、CAE中劑量組、強(qiáng)的松組和吡菲尼酮組小鼠肺組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)則顯著性下降(P0.01)。6.模型小鼠的肺成纖維細(xì)胞表達(dá)Vimentin強(qiáng)度高于正常小鼠的肺成纖維細(xì)胞(P0.01)。同時,模型小鼠的肺成纖維細(xì)胞中α-SMA的陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度均高于正常小鼠的肺成纖維細(xì)胞(P0.01)。7.在兩種肺成纖維細(xì)胞中加入不同濃度的CAE,MTT實(shí)驗結(jié)果表明CAE對兩種肺成纖維細(xì)胞增殖均有抑制作用(P0.05或P0.01),IC50結(jié)果顯示CAE對模型小鼠的肺成纖維細(xì)胞有更好的作用。8.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,經(jīng)過CAE干預(yù)后模型小鼠的肺成纖維細(xì)胞凋亡率明顯增加,且表現(xiàn)出劑量依賴性,同時熒光染色證實(shí)這個結(jié)果(P0.01);Western Blot結(jié)果顯示,給予CAE后,Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase8、Fas、FasL表達(dá)明顯升高(P0.05或P0.01);COX-2、EP2的表達(dá)隨藥物濃度的升高而逐漸增加(P0.05或P0.01)。提示CAE可能通過促進(jìn)COX-2表達(dá)啟動膜受體凋亡途徑誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞凋亡。9.氧化應(yīng)激熒光檢測結(jié)果顯示:經(jīng)CAE干預(yù)后,氧化應(yīng)激水平顯著升高(P0.05或P0.01),且Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-p38水平顯著升高。提示CAE對COX-2的調(diào)控作用可能與氧化應(yīng)激活促進(jìn)P38磷酸化有關(guān)結(jié)論:1.CAE能緩解博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺纖維化進(jìn)展,其作用可能與其抑制膠原分泌、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞、抑制肺成纖維細(xì)胞增殖方面有關(guān)。2.模型小鼠的肺成纖維細(xì)胞較正常小鼠的肺成纖維細(xì)胞有更好的研究價值。CAE可有效誘導(dǎo)模型小鼠肺成纖維細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激調(diào)控的p38/COX-2信號通路有關(guān)。
【圖文】：

而毛發(fā)無明顯異常；其余各組的小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)和食量均正常。逡逑３．２小鼠體重變化逡逑如圖２－１所示，除正常組小鼠體重一直在增加外，其余各組小鼠在造模后一周內(nèi)體重都逡逑是下降的，造模一周后體重逐漸開始增長。終體重比較結(jié)果表明，模型組小鼠與正常組小逡逑鼠相比體重明顯下降（戶＜0．0１），各給藥組與模型組相比體重有不同程度的升高，其中ＣＡＥ逡逑高劑量組、ＣＡＥ中劑量組及強(qiáng)的松組有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）（圖２－２）。逡逑３５－１逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑一邐ｈ？－邋ＢＬＭ逡逑Ｉ邋３0－邐Ｘ邋Ｍ逡逑Ｉ邐Ｔ邐—邋Ｌ逡逑■６＊邋２５－邐ＪＬ一＾一邋一＂Ｘ邐Ｉ邋－Ｏ－邋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ逡逑＾邐一邐Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑２０＋邐＾邐１邐？—逡逑０邐７邐１４邐２１邐２８逡逑Ｉ＇ｉ邋ｍｅ（邋ｃｌａｙｓ）逡逑圖２－ｌ邋ＣＡＥ對小鼠體重變化影響逡逑注：ＮｏｒｍｏＬ？正常組，ＢＬＭ：模型組，Ｈ：邋ＣＡＥ高劑量組，Ｍ：邋ＣＡＥ中劑量組，Ｌ：邋ＣＡＥ低劑量組，Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：逡逑強(qiáng)的松組，Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ：卩比菲尼酮組。逡逑３５－ｉ逡逑ｃｘ逡逑＾邐＊＊逡逑５￡邋３０－下逡逑ｉ．ｙ．．．逡逑｜邐■邐基品邋丁邋＊逡逑合邐＾邐＾邐＾逡逑，＇邐，ｖ。逡逑圖２－２邋ＣＡＥ對小鼠終體重影響逡逑注：Ｎｏｒｍｏｈ正常組，ＢＬＭ：模型組，Ｈ：邋ＣＡＥ高劑量組，Ｍ：邋ＣＡＥ中劑量組，Ｌ：邋ＣＡＥ低劑量組，逡逑Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：強(qiáng)的松組

而毛發(fā)無明顯異常；其余各組的小鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)和食量均正常。逡逑３．２小鼠體重變化逡逑如圖２－１所示，除正常組小鼠體重一直在增加外，其余各組小鼠在造模后一周內(nèi)體重都逡逑是下降的，造模一周后體重逐漸開始增長。終體重比較結(jié)果表明，模型組小鼠與正常組小逡逑鼠相比體重明顯下降（戶＜0．0１），各給藥組與模型組相比體重有不同程度的升高，其中ＣＡＥ逡逑高劑量組、ＣＡＥ中劑量組及強(qiáng)的松組有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）（圖２－２）。逡逑３５－１逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑一邐ｈ？－邋ＢＬＭ逡逑Ｉ邋３0－邐Ｘ邋Ｍ逡逑Ｉ邐Ｔ邐—邋Ｌ逡逑■６＊邋２５－邐ＪＬ一＾一邋一＂Ｘ邐Ｉ邋－Ｏ－邋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ逡逑＾邐一邐Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑２０＋邐＾邐１邐？—逡逑０邐７邐１４邐２１邐２８逡逑Ｉ＇ｉ邋ｍｅ（邋ｃｌａｙｓ）逡逑圖２－ｌ邋ＣＡＥ對小鼠體重變化影響逡逑注：ＮｏｒｍｏＬ？正常組，ＢＬＭ：模型組，Ｈ：邋ＣＡＥ高劑量組，Ｍ：邋ＣＡＥ中劑量組，Ｌ：邋ＣＡＥ低劑量組，Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：逡逑強(qiáng)的松組，Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ：卩比菲尼酮組。逡逑３５－ｉ逡逑ｃｘ逡逑＾邐＊＊逡逑５￡邋３０－下逡逑ｉ．ｙ．．．逡逑｜邐■邐基品邋丁邋＊逡逑合邐＾邐＾邐＾逡逑，＇邐，ｖ。逡逑圖２－２邋ＣＡＥ對小鼠終體重影響逡逑注：Ｎｏｒｍｏｈ正常組，ＢＬＭ：模型組，Ｈ：邋ＣＡＥ高劑量組，Ｍ：邋ＣＡＥ中劑量組，Ｌ：邋ＣＡＥ低劑量組，逡逑Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：強(qiáng)的松組
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2676109