【摘要】：目的:本實驗應(yīng)用脂多糖體外刺激SD大鼠脾臟組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)模擬膿毒癥時Treg細(xì)胞免疫狀態(tài),予以血必凈干預(yù)后,通過檢測Treg細(xì)胞特異性標(biāo)志物及功能、代謝相關(guān)細(xì)胞因子水平變化情況,以及共培養(yǎng)條件下對效應(yīng)性T細(xì)胞(Effective T cell,Teff)增殖分化和輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th)分化漂移的影響,以明確血必凈對Treg細(xì)胞免疫功能和代謝方面的調(diào)節(jié)作用;同時在血必凈應(yīng)用基礎(chǔ)上,加用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激動劑,通過檢測對Treg細(xì)胞代謝和AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響,以闡明AMPK在血必凈調(diào)節(jié)膿毒癥Treg細(xì)胞免疫功能中的作用。方法:1.磁激活細(xì)胞分選法(MACS)分選出正常SD大鼠脾臟組織CD4~+CD25~+Treg及CD4~+CD25~-Teff細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度;將體外分離的Treg細(xì)胞分為對照組、抗CD3/CD28組、抗CD3/CD28+LPS組、抗CD3/CD28+LPS+血必凈組,培養(yǎng)72h;2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CTLA-4/Foxp3表達(dá),使用ELISA法檢測Treg細(xì)胞上清中IL-10、TGF-β濃度;3.Treg與Teff按照細(xì)胞數(shù)1:1共培養(yǎng)68h后,CFSE染色法測Teff細(xì)胞的增殖,使用ELISA法測定共培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IFN-γ濃度;4.FCM檢測Treg的CPT-1和GLUT1強度和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;5.將提取到的Treg細(xì)胞分為對照組、抗CD3/CD28組、抗CD3/CD28+LPS組、抗CD3/CD28+LPS+A-769662組、抗CD3/CD28+LPS+血必凈組、抗CD3/CD28+LPS+血必凈+A-769662組,重復(fù)上述實驗。用WB方法檢測各組p-AMPKα和AMPKα表達(dá)。結(jié)果:1.抗CD3/CD28+LPS組CTLA-4、Foxp3表達(dá)量、IL-10/TGF-β濃度最高,對Teff增殖的抑制能力最強,并且抗CD3/CD28+LPS組IFN-γ/IL-4濃度比值最低;抗CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組Treg細(xì)胞CTLA-4、Foxp3表達(dá)量以及上清中IL-10和TGF-β含量明顯降低(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必凈組CD4~+CD25~-Teff細(xì)胞Divided%顯著高于抗CD3/CD28+LPS組(P0.05),共培養(yǎng)上清中IFN-γ/IL-4濃度比值也明顯升高(P0.05);2.FCM結(jié)果顯示:抗CD3/CD28+LPS組CPT-1和GLUT1表達(dá)顯著高于其余各組(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組接近于抗CD3/CD28組(P0.05)。抗CD3/CD28+LPS組Treg細(xì)胞內(nèi)ROS含量為1014.333±49.136,顯著高于其余各組(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組Treg細(xì)胞內(nèi)ROS含量接近正常;3.與抗CD3/CD28組相比,抗CD3/CD28+LPS組p-AMPKα表達(dá)顯著增加(P0.05),抗CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組AMPKα磷酸化顯著降低(P0.05);與抗CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組相比,抗CD3/CD28+LPS+血必凈+A-769662組AMPKα磷酸化水平明顯升高(P0.05)。結(jié)論:1.血必凈能有效緩解體外細(xì)胞模擬膿毒癥調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制狀態(tài);2.在體外模擬膿毒癥狀態(tài)下,Treg細(xì)胞主要的代謝方式是FAO和糖酵解,使用血必凈能有效抑制兩種代謝方式,并且通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,避免膿毒癥時線粒體的損傷;3.血必凈通過限制AMPKα磷酸化影響LPS刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫代謝。
【圖文】：

大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、血必凈對脂多糖誘導(dǎo)大鼠調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞免疫功能結(jié)果D4+CD25+Treg 細(xì)胞純度與活性 SD 大鼠脾臟單個核細(xì)胞經(jīng)由 MACS 磁珠兩次陽選后，CD4+CD2平均為(95.23±1.46)%(圖 1.1)。根據(jù)臺盼藍(lán)排斥實驗測定所獲25+Treg 細(xì)胞的活性為(93.34±2.01)%，滿足進(jìn)行后續(xù)實驗操作的要

圖 1.2 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面標(biāo)志物 CTLA-4 及轉(zhuǎn)錄因子 Foxp31.3.3 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞上清液中 IL-10、TGF-β 的濃度抗 CD3/CD28+LPS 組 Treg 細(xì)胞上清液中 IL-10 和 TGF-β 水平最高，，顯于其余各組(P<0.05)；和抗 CD3/CD28+LPS 組相比，抗 CD3/CD28+LPS+血(20μl/ml)組能有效降低上清中 IL-10 含量(P<0.05)，但不能將 IL-10 含量恢復(fù)常水平。而抗 CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組上清中的 TGF-β 濃度接近常對照組和抗 CD3/CD28 組(P>0.05)。表 1.2 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞上清液中 IL-10、TGF-β 的濃度分組 IL-10(pg/ml) TGF-β(pg/ml)對照組 91.783±2.075 403.750±16.750抗 CD3/CD28 組 95.859±6.125 416.961±23.871抗 CD3/CD28+LPS 組 378.863±25.810ab511.284±29.209a抗 CD3/CD28+LPS+血必凈(20μl/ml)組 265.208±48.701abc450.703±38.784c注：a：與對照組比較，P<0.05；b：與抗 CD3/CD28 組比較，P<0.05；c：與抗 CD3/CD28
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2673750