【摘要】：目的高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞與鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)Sprague-Dawley(SD)大鼠作為模型,探討枸杞多糖(LBP)對(duì)糖尿病心肌病大鼠的保護(hù)作用。方法在含5%CO_2 37℃恒溫孵箱中,用含10%胎牛血清、1%鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞。按照加藥劑量將細(xì)胞分為9組:對(duì)照組;HG_1(50mM/l)組;HG_1+LBP(30μg/ml)組;HG_1+LBP(60μg/ml)組;HG_1+LBP(90μg/ml)組;HG_2(100mM/l)組;HG_2+LBP(30μg/ml)組;HG_2+LBP(60μg/ml)組;HG_2+LBP(90μg/ml)組。實(shí)驗(yàn)期間,LBP培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞24小時(shí)后,高葡萄糖(HG)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞24h,收集貼壁細(xì)胞和培養(yǎng)基,用MTT法檢測H9c2心肌細(xì)胞存活力;用熒光染料二氫乙啶(DHE)染色法測定心肌細(xì)胞活性氧(ROS)的含量;評(píng)估細(xì)胞的損傷程度及抗氧化酶活性,檢測細(xì)胞培養(yǎng)基或心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量或活性。從60只成年雄性SD大鼠中,隨機(jī)選取50只大鼠連續(xù)5天進(jìn)行腹腔注射STZ(50mg/kg),只有在一次注射STZ后72小時(shí)大鼠具有高血糖癥(≥16.7mmol/l),被視為糖尿病模型制造成功,其余10只SD大鼠作對(duì)照組。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為三組(n=10):STZ組,STZ+LBP(60mg/kg/d)組和STZ+LBP(30mg/kg/d)組,枸杞多糖組灌胃持續(xù)12周,STZ組灌胃同體積的水,密切觀察灌胃前后動(dòng)物的健康狀況。給藥結(jié)束后,采用20%烏拉坦(1g/kg)麻醉各組大鼠,內(nèi)眥靜脈取血,測大鼠空腹血糖;稱取大鼠體重、心臟和左心室重量,計(jì)算心臟重量/體重比(HW/BW)和左心室重量/體重比(LVW/BW);實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測心臟組織內(nèi)心房利鈉肽(ANP)和腦利鈉肽(BNP)mRNA的水平;用HE染色法觀察心肌形態(tài)學(xué)的變化;檢測血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量;蛋白印跡方法測定心臟組織中細(xì)胞間內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、鈣蛋白酶-1(calpain-1)、TNF-α、IL-6、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細(xì)胞粘附分子(VCAM)-1、Smad2/3、核因子-кB(NF-кB)和抑制蛋白кB(iкB)-α、磷酸化核因子-кB(P-NF-кB)和磷酸化抑制蛋白кB(P-iкB)-α蛋白的表達(dá)水平;免疫組化法測定組織中p65(NF-кB亞基)的核內(nèi)轉(zhuǎn)移量。結(jié)果(1)體外實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比,(1)HG_1和HG_2組H9c2心肌細(xì)胞存活力減少,分別至70.63%和60.54%;(2)HG組ROS的產(chǎn)生顯著性增加;(3)HG組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力增加;(4)HG組心肌細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力下降;(5)HG作用增加了MDA的濃度,減少了GSH的含量,降低了SOD、過氧化氫酶與GSH-Px酶的活性。與HG相比,(1)LBP作用不同程度地增加了細(xì)胞存活力;(2)LBP組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少;(3)LBP減少心肌細(xì)胞LDH的漏出量;(4)LBP改善細(xì)胞的總抗氧化能力;(5)LBP降低了心肌細(xì)胞MDA濃度,增加了GSH含量和抗氧化酶的活性。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):STZ組與空白組相比,(1)大鼠空腹血糖值明顯增高,心臟重量/體重及左心室重量/體重比值增大,心臟組織中心肌細(xì)胞排列紊亂、心肌纖維束寬松;(2)心臟組織中ANP和BNP mRNA和蛋白的表達(dá)水平增加;(3)心肌中ROS產(chǎn)生明顯增加;(4)心臟組織中SOD、CAT活性和GSH的含量降低,而MDA產(chǎn)生增加;(5)心臟組織中eNOS蛋白表達(dá)下調(diào),iNOS蛋白表達(dá)上調(diào);(6)血清中的IL-6與TNF-α含量及組織中IL-6與TNF-α的蛋白表達(dá)增加;(7)心臟組織中ICAM-1、VCAM-1、TLR4和smad2/3的蛋白表達(dá)上調(diào);(8)心臟組織中calpain-1蛋白的表達(dá)增加;(9)心臟組織細(xì)胞核內(nèi)NF-кB和P-NF-кB蛋白的表達(dá)量增加,細(xì)胞質(zhì)iкB-α和P-iкB-α蛋白的表達(dá)量減少;(10)心臟組織中p65的核內(nèi)轉(zhuǎn)移量增加。STZ+LBP(60,30)組與STZ組相比,(1)大鼠空腹血糖值降低,但仍高于空白組;心臟重量/體重與左心室重量/體重比值降低,心肌組織細(xì)胞紊亂、纖維束寬松程度有所改善;(2)心臟組織中ANP和BNP mRNA和蛋白的表達(dá)減少;(3)心肌中ROS的產(chǎn)生減少;(4)心臟組織中SOD、CAT活性和GSH的含量增加,而MDA含量降低;(5)心臟組織中eNOS蛋白表達(dá)上調(diào),iNOS蛋白表達(dá)下調(diào);(6)血清中的IL-6與TNF-α含量及組織中IL-6與TNF-α的蛋白表達(dá)量降低;(7)心臟組織中ICAM-1、VCAM-1、TLR4和smad2/3的蛋白表達(dá)下調(diào);(8)心臟組織中calpain-1蛋白表達(dá)量減少;(9)心臟組織細(xì)胞核內(nèi)NF-кB和P-NF-кB蛋白表達(dá)含量減少,細(xì)胞質(zhì)iкB-α和P-iкB-α蛋白含量增多;(10)心臟組織中p65入核轉(zhuǎn)移減少。結(jié)論(1)LBP降低糖尿病大鼠的血糖值。(2)LBP減輕糖尿病大鼠心臟內(nèi)氧化應(yīng)激的的水平。(3)LBP對(duì)糖尿病心肌病大鼠具有保護(hù)作用,可能與枸杞多糖減輕氧化應(yīng)激與炎癥浸潤,抑制calpain-1的活性和NF-кB的激活相關(guān)。
【圖文】：

圖1.1 LBP對(duì)心肌細(xì)胞Cell viability的影響數(shù)據(jù)表示為 x ±SEM，n=4，與control組相比#P <0.05，##P <0.01，與HG1組相比*P <0.05，**P <0.01，與HG2組相比★P<0.05，★★P<0.01。2、LBP減輕高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激采用DHE染色法測定各組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，代表性圖片如圖1.2A所示，與對(duì)照組相比，HG1和HG2組細(xì)胞ROS的產(chǎn)生顯著性增加（圖1.2B）；與HG組相比，使用LBP可以不同程度地減少細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，同時(shí)，分別與HG1、HG2組相比，LBP（60和90μg/ml）減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，上述結(jié)果表明了LBP可以減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

圖1.2 LBP對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響A：H9c2心肌細(xì)胞的代表性的乙錠熒光圖像（×200）， B：ROS水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果的相對(duì)熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示為 x ±SEM，n=4，與control組相比#P <0.05，##P <0.01，與HG1組相比*P <0.05，**P <0.01，與HG2組相比★P<0.05，★★P<0.01。3、LBP降低高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞上清液LDH水平LDH活力水平結(jié)果如圖1.3所示，與對(duì)照組相比，HG1和HG2組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性增加；與HG組相比，LBP減少了細(xì)胞中LDH的漏出量，分別與HG1、HG2組相比，LBP（60和90μg/ml）使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活力下降，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，上述結(jié)果表明了LBP減輕了HG介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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1 胡志斌;李U喢

本文編號(hào)：2662390