【摘要】：1.目的中藥材砂仁具有化濕開胃、理氣安胎、溫脾止瀉之功效,其主要來源于陽春砂Awomum villosum Lour.的干燥成熟的果實,砂仁的主要的藥效成分為萜類化合物,如乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦等。萜類合酶(terpene synthase,TPS)是萜類下游生物合成途徑的關鍵酶。前期研究已經(jīng)從陽春砂轉(zhuǎn)錄組中篩選出了 10個TPS基因,并鑒定了其中的蒎烯合酶和龍腦基二磷酸合酶(BPPS,bomyl diphosphate synthase)。由于陽春砂含有的萜類成分十分豐富,尤其在藥用部位果實中富含單萜和倍半萜,負責這些單萜和倍半萜合成的TPS還有待挖掘。因此,本研究從近期獲得的果實為主的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘更多的TPS基因,并對其進行克隆和功能鑒定,以期更全面地認識陽春砂果實中的揮發(fā)性萜類的生物合成及其TPS家族,同時也為揮發(fā)性萜類的代謝工程提供更豐富的候選基因。另一方面,課題組前期已獲得的陽春砂藥效萜類合成途徑中最關鍵的TPS——龍腦基二磷酸合酶(bomyl diphosphate synthase,AvBPPS),其特殊性不僅在于其產(chǎn)物多樣,且其主產(chǎn)物龍腦基二磷酸(BPP)是陽春砂主要藥效萜類物質(zhì)乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦的直接或間接前體。海南砂Amomum longiligular T.L.Wu是陽春砂的近源物種,也是砂仁的來源植物,本研究克隆海南砂的BPPS,同時合成文獻已報道的LdBPPS(來源于甜舌草Lippia dulcis),將AvBPPS與這兩個BPPS進行功能比較和氨基酸序列比對,以期發(fā)現(xiàn)關鍵氨基酸位點,為優(yōu)化AvBPPS的功能提供基礎。2.方法2.1陽春砂果實轉(zhuǎn)錄組測序及揮發(fā)性萜類2.1.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及AvTPS挖掘以陽春砂兩個成熟期(45 DAF和75 DAF)果實的果皮、種子團和根狀莖為材料(每個組織部位設置3個生物學重復),進行轉(zhuǎn)錄組測序,對測序質(zhì)量、注釋信息進行分析。以已知的AvTPS1-10候選基因的序列進行本地blast,再結(jié)合Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果,篩選出預測為TPS的全部unigene,然后濾去序列小于500bp的unigene,且合并可能為同一TPS的unigene,最終獲得候選的AvTPS。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的RPKM值初步分析候選AvTPS的組織表達模式和與揮發(fā)性萜類含量的相關性。2.1.2陽春砂萜類化合物的提取與測定用正己烷超聲提取法,提取45 DAF果皮(PYF)、45 DAF種子團(SYF)、75 DAF果皮(PF)、75 DAF種子團(SF)、根狀莖(CS)中的揮發(fā)性萜類化合物,用GC-MS對上述部位的萜類化合物進行測定,用標準品制作標曲進行定量。2.2候選TPS基因的克隆與功能鑒定2.2.1 TPS基因的克隆及原核表達以目的基因表達量高的組織部位cDNA為模板,克隆候選的TPS基因,構(gòu)建重組克隆載體,并以重組克隆載體質(zhì)粒為模板,采用In-fusion方法構(gòu)建帶有雙His標簽的pET 32a重組原核表達載體,利用Rosetta(DE3)表達菌株進行原核表達。2.2.2 TPS蛋白純化及功能鑒定利用IPTG誘導融合TPS蛋白表達,用Ni-NTA柱純化融合蛋白,并以GPP或FPP為底物進行體外酶促反應,通過GC-MS檢測TPS催化產(chǎn)物。2.2.3基因表達模式分析以陽春砂75 DAF種子團(SF)、75 DAF果皮(PF)、花(F)、葉(L)、根狀莖(CS)為材料,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用實時熒光定量的方法檢測TPS在陽春砂各組織部位的表達量,與不同組織部位中檢測到的揮發(fā)性萜類化合物的含量進行相關性分析。2.2.4 TPS gDNA及啟動子的克隆以陽春砂葉片基因組DNA(gDNA)為模板,克隆TPS的gDNA序列,根據(jù)目的基因的gDNA序列設計三條特異性引物,用FPNI-PCR的方法從陽春砂gDNA中克隆目的基因的啟動子,并分析啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點以及順式表達元件。2.3 BPPS的功能比較2.3.1海南砂BPPS的克隆和表達載體構(gòu)建從海南砂未成熟的種子團轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選候選的TPS基因,進行序列比對和系統(tǒng)進化樹分析,選取與陽春砂AvBPPS相似性最高的序列設計引物,采用巢式PCR的方法擴增其編碼區(qū),采用In-fusion的方法將AvBPPS-T47和AlBPPS的片段構(gòu)建到pET-32a表達載體中。2.3.2甜舌草LdBPPS的合成從GenBank下載甜舌草LdBPPS的核苷酸序列(MF133333.1),委托公司合成其原核表達的編碼區(qū),并構(gòu)建到pET32a表達載體中。2.3.3不同BPPS的催化產(chǎn)物比較原核表達和蛋白純化的方法同2.2.1和2.2.2,為了檢測到產(chǎn)物龍腦,底物反應后加入堿性磷酸酶,對產(chǎn)物進行脫磷酸處理,進行GC-MS檢測。2.3.4陽春砂和海南砂BPPS在果皮和種子團中的表達模式分別以陽春砂45 DAF果皮(AvP)、陽春砂45 DAF種子團(AvS)、海南砂45 DAF果皮(AlP)、海南砂45 DAF種子團(AlS)為材料,用實時熒光定量的方法檢測基因相對表達量,將基因表達量與相應萜類產(chǎn)物含量進行相關性分析。3.結(jié)果1.陽春砂果實轉(zhuǎn)錄組、AvTPS篩選及揮發(fā)性萜類分析果實轉(zhuǎn)錄組的組裝質(zhì)量較好,所獲得的unigene序列普遍較長,在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋率高達99.48%;KEGG代謝通路中,次生代謝生物合成途徑中注釋到unigene最多;萜類骨架合成途徑中,MEP途徑注釋到的unigene多于MVA途徑。篩選出了22個候選的AvTPS,包括6個單萜合酶、9個倍半萜合酶和7個二萜合酶基因,熱圖分析表明各基因在不同組織中的表達量有差異。萜類化合物的檢測結(jié)果表明陽春砂中含有豐富的揮發(fā)性萜類化合物,總共檢測到了 45種萜類化合物,其中包括單萜17種、倍半萜27種和1種二萜類成分,乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦等都在陽春砂種子團中被檢測到,SF中的揮發(fā)性萜類總含量高于SYF,PF中的揮發(fā)性萜類總量也高于PYF,表明果實從45 DAF到75 DAF過程中,揮發(fā)性萜類物質(zhì)仍處于積累的過程中。種子團中單萜化合物的種類比果皮和根狀莖中的豐富,萜類含量也高于果皮和根狀莖,但果皮和根狀莖中檢測到了一種二萜化合物,是種子團中未檢測到的。22個AvTPS在5個組織部位的RPKM值與45種揮發(fā)性萜類含量的相關性分析顯示:被預測為單萜合酶的TPS與部分單萜化合物具有較高的相關性,被預測為倍半萜合酶的TPS不僅與單萜化合物相關性高,且與倍半萜化合物也具有較高的相關性,部分二萜合酶與二萜化合物相關性較高。2候選TPS基因的克隆與功能鑒定系統(tǒng)發(fā)育進化樹將22個AvTPS聚類到7個不同的亞家族中,其中單萜合酶聚類到TPS-b亞家族,倍半萜合酶主要聚類到TPS-a亞家族,二萜合酶主要聚類到TPS-c和d亞家族。成功克隆了其中9個AvTPS,包括1個單萜合酶基因AvTPS2,5個倍半萜合酶基因-AvTPS6、AvTPS15、AvTPS16、AvTPS17、AvTPS18和3個二萜合酶基因-AvTPS5、AvTPS9、AvTPS19,構(gòu)建了原核表達載體,并進行了蛋白純化。AvTPS2、AvTPS5、AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18五個基因的蛋白表達效果較好;AvTPS17和AvTPS19兩個基因誘導的蛋白均為包涵體:AvTPS9和AvTPS16兩個基因并未誘導出目的蛋白。AvTPS2與GPP反應的主產(chǎn)物為linalool,副產(chǎn)物為β-myrcene、limonene、trans-β-ocimene、β-cis-ocimene、carene,可將 AvTPS2 命名為芳樟醇合酶;AvTPS2 在PF和花中表達量較高,在SF和CS中幾乎不表達,在PF和花中檢測到其主產(chǎn)物linalool,在SF和CS中均未檢測到該化合物。AvTPS6與GPP反應的主產(chǎn)物為(2E)-1-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene,副產(chǎn)物為β-myrcene、limonene、α-terpinene、α-terpineol、cis-geraniol;與 FPP 反應的主產(chǎn)物為 humulene,副產(chǎn)物為 caryophyllene,可將AvTPS6命名為凬草烯合酶;AvTPS6在SF中的表達量高于PF,且在SF檢測到humulene的含量高于PF,與表達模式一致。AvTPS15與GPP反應的產(chǎn)物為β-myrcene、limonene、cis-β-terpineol、β-terpinene、linalool、linalool methyl ether、α-terpineol、(2E)-l-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene、Geraniol;與 FPP 反應的主產(chǎn)物為α-santalene和α-bergamotene,副產(chǎn)物為(Z)-γ-bisabolene、β-sesquiphellandrene,可將其命名為檀香烯/α-香柑油烯合酶,AvTPS15在SF中高表達,而其催化的主產(chǎn)物α-santalene和cis-α-bergamotene,正是在SF中檢測到的;AvTPS18與GPP反應的主產(chǎn)物為(2E)-l-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene,與 FPP 反應產(chǎn)物為β-elemene,將其命名為欖香烯合酶,AvTPS18在PF和CS中表達量較高,在SF中也有表達,而其催化產(chǎn)物β-elemene僅在SF中檢測到。另外,克隆了AvTPS2和AvTPS6包含完整編碼區(qū)的基因組序列,它們都含有7個外顯子和6個內(nèi)含子,基因組結(jié)構(gòu)與已報道的單萜或倍半萜合酶基因相似。進一步克隆獲得了AvTPS6的啟動子片段,分析發(fā)現(xiàn)其具有TATA-box和G-box等順式調(diào)控元件。2.龍腦基二磷酸合酶BPPS的功能比較從海南砂轉(zhuǎn)錄組中篩選到與AvBPPS最相似的基因AlBPPS,從種子團cDNA克隆獲得其1791bp的編碼區(qū)序列。系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明,其與AvBPPS聚為一支,均屬于TPS-b亞家族;多序列比對結(jié)果表明AlBPPS與其它物種的BPPS序列一致性為60.06%,與AvBPPS的序列一致性為82.55%,兩者的保守結(jié)構(gòu)域序列幾乎一致,僅在“DTE”中有一個氨基酸差異位點,AlBPPS(A496)為丙氨酸(A),AvBPPS(G495)則為甘氨酸(G)。AlBPPS的轉(zhuǎn)運肽為47aa,其他BPPS在原核表達時截去的N端長度都比AvBPPS截去的更長,因此,本研究也對截去更長N端的AvBPPS-T47(N端截去 47 個氨基酸)進行了研究。比較 AvBPPS-T26、AvBPPS-T47、AlBPPS、LdBPPS與GPP反應并脫磷酸后的產(chǎn)物,4個BPPS均產(chǎn)生了龍腦,AvBPPS-T26的催化產(chǎn)物中龍腦的產(chǎn)量占產(chǎn)物總量57.55%,camphene、limonene、β-mycrene分別占21%、19%、6%;AvBPPS-T47的催化產(chǎn)物中borneol、camphene、limonene占產(chǎn)物總量的百分比均有所下降,同時產(chǎn)生了新的化合物α-pinene,但龍腦的產(chǎn)量相比于AvBPPS-T26有所提高;AlBPPS的催化產(chǎn)物中camphene作為主產(chǎn)物,占總產(chǎn)量的59.92%,bomeol和limonene則分別占21.16%和6.21%,其他副產(chǎn)物的總和占12.70%;LdBPPS的反應產(chǎn)物經(jīng)過脫磷酸后產(chǎn)生6種化合物,其中camphene占總產(chǎn)量的45.31%,borneol、limonene、α-pinene、terpinolene、β-mycrene 分別占總產(chǎn)量的 24.72%、11.36%、8.47%、6.06%、4.08%。AvBPPS-T26催化產(chǎn)物中龍腦的比率最高,LdBPPS催化產(chǎn)物種類最豐富。半定量的結(jié)果表明AvBPPS、AlBPPS在主要在種子團中表達,實時熒光定量表明陽春砂45 DAF種子團(AvZ)中的表達量遠高于海南砂45 DAF種子團(AlZ),且在海南砂45 DAF果皮(AlP)中低表達,在陽春砂45 DAF果皮(AvP)中不表達,與對應組織部位中檢測到的直接或間接催化產(chǎn)物的含量總和的趨勢基本一致。4.結(jié)論本文從陽春砂以果實為主的轉(zhuǎn)錄組中篩選到了 22個候選的AvTPS,克隆并鑒定了其中1個單萜合酶(AvTPS2)和3個倍半萜合酶(AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18)基因,根據(jù)其主產(chǎn)物分別命名為芳樟醇合酶、凬草烯合酶、檀香烯/α-香柑油烯合酶和欖香烯合酶,其在不同組織部位的表達模式與萜類產(chǎn)物含量基本一致,它們均為多產(chǎn)物的TPS,其中AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18是雙功能合酶,既能催化GPP,也能催化FPP生成多樣的萜類產(chǎn)物。本文的研究結(jié)果豐富了對陽春砂揮發(fā)性萜類合成機制的認識。對AvBPPS-T26、AvBPPS-T47、AlBPPS、LdBPPS脫磷酸產(chǎn)物中龍腦比率的比較,為后續(xù)優(yōu)化AvBPPS的功能提供了基礎。
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廣州中醫(yī)藥大學２０１９屆碩士學位論文ｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＰＳ）、櫳牛兒邋樵牛兒基焦磷ｎｙｌ邋ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＧＰＰＳ）的作用下經(jīng)頭尾縮合生們分別是單萜、倍半萜、二萜化合物的前體物質(zhì)＾￣１８］。在ＴＰ的單萜，倍半萜和二萜，最后通過修飾酶作用下形成結(jié)構(gòu)和這一階段決定了萜類化合物結(jié)構(gòu)的多樣性。逡逑

廣州中醫(yī)藥大學２０１９屆碩士學位論文邐逡逑、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動不安等癥，中藥飲片的煎制方法為后下，以便更好逡逑揮其藥效作用。陽春砂的果實中富含揮發(fā)油，油中主要含有乙酸龍腦酯（ｂｏｍｙｌ逡逑ｔａｔｅ）、樟腦（ｃａｍｐｈｏｒ）、龍腦（ｂｏｒｎｅｏｌ）等成分，，主要為x2類化合物，其中乙酸逡逑酯作為砂仁的質(zhì)量評價指標Ｍ。另外，陽春砂中也包含其他單萜和倍半萜等多種逡逑性萜類化合物。逡逑龍腦基二磷酸合酶ＢＰＰＳ的研宄進展逡逑龍腦基二a愃岷廈福ǎ猓錚恚戾澹洌椋穡瑁錚螅穡瑁幔簦邋澹螅睿簦瑁幔螅�，n校校櫻┦譴嬖謨謚參鍰迥詰囊誨義鮮獾模裕校櫻謚參锎渭洞徊锏暮銑賞揪噸校攏校校幽芄淮呋孜錚牽校猩閃義隙姿�，进一步通过磷酸酶的催化作用生抽W裕栽蚍直鷦諞陰Ｗ潑負兔傅淖饔孟律梢宜崍怎ズ駝聊�，壤_跡�，因此龙脑基二磷酸是龙脑、樟脑壶r義義夏怎サ鬧苯踴蚣浣憂疤褰校虼�，n校校釉蛉銜嗆銑裳舸荷爸饕臃⑿暫評嗷義系墓丶浮ｅ義

本文編號：2656830