【摘要】：研究背景:臨床研究表明雌激素參與女性的情緒調(diào)節(jié)。在更年期過渡期間,卵巢雌激素分泌減少會導(dǎo)致情緒障礙,其中焦慮和抑郁是更年過渡期出現(xiàn)的主要癥狀。Mulhall等人的研究表明,與絕經(jīng)前相比,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后階段女性往往伴隨有焦慮和抑郁癥狀的增加。一項多中心的橫斷面研究表明,抑郁情緒與絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平的降低顯著相關(guān)。動物研究也同樣證實雌激素水平對情緒行為具有重要影響。在發(fā)情周期的間情階段,低水平的雌激素導(dǎo)致嚙齒類動物出現(xiàn)抑郁樣行為。卵巢切除術(shù)導(dǎo)致的雌激素缺乏會導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。此外,4-乙炔-環(huán)己烷氧化物引起的卵巢功能衰竭往往會導(dǎo)致焦慮行為的出現(xiàn)。在大鼠的幼年發(fā)育階段和絕經(jīng)期雌激素下降階段,雌二醇對雌性大鼠的情緒和精神行為的正常維持起著十分關(guān)鍵的作用。有研究表明,雌激素替代可減少老年雌性大鼠的焦慮和抑郁行為,提高認知能力。臨床和臨床前研究也表明,雌激素替代治療具有抗抑郁作用。值得注意的是,長期應(yīng)用雌激素可能會引起一些嚴重的副作用,包括動脈粥樣硬化、乳腺癌和其他癌癥的風險增加。因此,研究和尋找一種安全的治療抑郁癥和焦慮的方法顯然很有意義。白藜蘆醇是一種由葡萄和其他一些植物的表皮產(chǎn)生的天然酚類物質(zhì),同時也是沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1,SIRT1)受體的激活劑。越來越多的證據(jù)表明白藜蘆醇可能對情緒障礙有治療作用。白藜蘆醇可減輕慢性糖皮質(zhì)激素暴露引起的抑郁樣行為和代謝紊亂。我們前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇預(yù)處理小鼠2周,能有效改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的小鼠的抑郁樣行為。此外,白藜蘆醇還能抑制高脂飲食引起的小鼠焦慮樣行為。已有研究顯示,雌激素缺乏可導(dǎo)致海馬齒回(dendate gyrus,DG)小膠質(zhì)細胞過度激活和促炎細胞因子的過度分泌,進而抑制海馬神經(jīng)發(fā)生,并參與抑郁樣行為的發(fā)生。白藜蘆醇能否抑制由雌激素缺乏引起的DG神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生異常,進而改善抑郁和焦慮行為,目前尚不清楚。鑒于雌激素水平下降與焦慮和抑郁行為的相關(guān)性,及炎癥引起海馬神經(jīng)發(fā)生的抑制是介導(dǎo)抑郁樣行為發(fā)生的病理改變之一。且白藜蘆醇對LPS誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥所致的抑郁樣行為具有顯著的改善作用,我們推測:卵巢切除術(shù)所致的焦慮和抑郁樣行為可能與海馬的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生異常有關(guān),白藜蘆醇可能通過激活其經(jīng)典的Sirt1通路,調(diào)控NLRP3炎癥小體以及海馬炎癥反應(yīng)和神經(jīng)發(fā)生對小鼠焦慮和抑郁樣行為產(chǎn)生治療作用。研究方法:雌性C57BL/6J小鼠(6-8周齡,17-20 g)進行卵巢切除術(shù)。術(shù)后用白藜蘆醇進行治療,使用劑量為20mg/kg,持續(xù)注射2周,對照組給予等量二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)。實驗分為以下4組:(i)假手術(shù)+溶劑組,(ii)卵巢切除+溶劑組,(iii)假手術(shù)+白藜蘆醇組,(iv)卵巢切除+白藜蘆醇組。采用行為學(xué)方法檢測小鼠的焦慮樣和抑郁樣行為以及白藜蘆醇的治療作用。采用溴代去氧吡啶(bromodeoxyuridine,BrdU)標記來評估海馬齒狀回的細胞增殖情況。采用免疫組化和RT-PCR檢測小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活和細胞因子的變化,蛋白免疫印跡檢測Sirt1蛋白水平的變化。研究結(jié)果:1.白藜蘆醇和卵巢切除對小鼠體重、血清雌二醇濃度和子宮重量的影響(1)卵巢切除+溶劑組小鼠的體重明顯高于假手術(shù)+溶劑組(p=0.011),白藜蘆醇可使溶劑組和卵巢切除組小鼠體重明顯減輕(卵巢切除+溶劑組vs卵巢切除+白藜蘆醇組,p0.01;假手術(shù)+溶劑組vs假手術(shù)+白藜蘆醇組,p0.01);(2)小鼠卵巢切除后小鼠雌二醇濃度水平顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(3)卵巢切除后的雌性小鼠子宮萎縮,子宮重量較正常對照小鼠顯著減輕(p0.01);2.白藜蘆醇和卵巢切除對小鼠焦慮抑郁樣行為的影響(1)開場實驗可以檢測小鼠的運動功能,中央時間可以反映小鼠的焦慮情況。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除+溶劑組在曠場行為學(xué)檢測中移動的距離明顯少于假手術(shù)+溶劑組(p0.01),中心時間明顯縮短(p0.01)。白藜蘆醇干預(yù)后,去卵巢小鼠在曠場行為學(xué)檢測中移動的距離顯著升高(p=0.019),去勢小鼠的總中心時間顯著增加(p=0.015),提示焦慮樣行為得到顯著改善。上述研究提示藜蘆醇的干預(yù)可緩解雌激素缺乏引起的焦慮樣行為;(2)高架十字迷宮(high plus-maze,EPM)檢測可評估小鼠的焦慮水平。研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組小鼠相比,卵巢切除組小鼠在迷宮開臂的時間更短(p0.01),進入開臂的比例更低(p0.01),證實卵巢切除組小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。白藜蘆醇的干預(yù)顯著提高了卵巢切除組小鼠進入開臂的時間百分比(p0.01),但進入開臂頻率的百分比的無顯著變化(p=0.145);(3)明暗箱行為學(xué)測試為評估小鼠的焦慮程度的另一種行為學(xué)檢測方法。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除組小鼠較假手術(shù)組小鼠的暗箱時間明顯增加(p0.01),而白藜蘆醇的干預(yù)可以有效降低卵巢切除組小鼠的暗箱時間(p=0.030),但對穿梭次數(shù)無顯著影響(p=0.094);上述結(jié)果證實了白藜蘆醇的干預(yù)可緩解小鼠雌激素缺乏引起的焦慮樣行為;(4)懸尾行為學(xué)測試(Tail suspension test,TST)和強迫游泳行為學(xué)測試(Forced swimming test,FST)用于檢測小鼠的抑郁程度。懸尾實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,去卵巢的小鼠在懸尾測試中表現(xiàn)出更長的靜止時間(p0.01),而白藜蘆醇干預(yù)可顯著縮短去卵巢小鼠靜止時間(p=0.020)。與懸尾行為學(xué)測試結(jié)果一致,強迫游泳結(jié)果顯示,去卵巢小鼠的靜止時間明顯長于假手術(shù)對照組小鼠(p0.01),白藜蘆醇顯著降低了去卵巢小鼠強迫游泳實驗的靜止時間(p0.01);上述結(jié)果提示白藜蘆醇的干預(yù)可緩解小鼠雌激素缺乏引起的抑郁樣行為;(5)三箱社交行為學(xué)用于檢測小鼠的社交行為。在三箱社交行為學(xué)測試中,正常社交行為表現(xiàn)為小鼠和物體間小鼠更偏向與小鼠交流。研究結(jié)果顯示,卵巢切除和白藜蘆醇干預(yù)對小鼠的社交能力無顯著影響;(6)新物體識別(novel object recognition,NOR)行為學(xué)用于檢測小鼠的認知功能,其中識別指數(shù)(Discrimination Index,DI)反映的是小鼠對新目標進行探索的時間與對熟悉目標進行探索時間之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除和白藜蘆醇干預(yù)對小鼠的DI無明顯影響(p=0.907),提示卵巢切除和白藜蘆醇干預(yù)對短期記憶無顯著影響。Y迷宮中的自發(fā)交替率被研究者用作檢測空間工作記憶的指標。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除和白藜蘆醇干預(yù)對小鼠的自發(fā)性交替率無顯著影響(p=0.982);3.白藜蘆醇干預(yù)改善卵巢切除小鼠焦慮抑郁樣行為的作用機制(1)海馬神經(jīng)發(fā)生異常與焦慮和抑郁樣行為的發(fā)生密切相關(guān)。本研究采用BrdU標記及免疫組化染色分析小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除和白藜蘆醇干預(yù)對小鼠海馬齒回神經(jīng)干細胞的增殖無顯著影響(p=0.406);(2)離子鈣接頭分子蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)為小膠質(zhì)細胞標記。免疫組化結(jié)果顯示,卵巢切除術(shù)后,小鼠海馬齒狀回的Iba-1陽性細胞數(shù)量較對照組顯著增加(p0.01),且小膠質(zhì)細胞的形態(tài)主要為細胞體積較大,胞質(zhì)致密的激活狀態(tài)。經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后,激活態(tài)小膠質(zhì)細胞的數(shù)量較卵巢切除組小鼠顯著減少(p0.05),提示白藜蘆醇可抑制因雌激素水平下降導(dǎo)致的海馬神經(jīng)炎癥;(3)NLRP3炎癥小體和NF-κB為重要的炎癥信號通路。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3和NF-κB的mRNA水平在卵巢切除組小鼠海馬中的表達較對照組顯著增加(p0.01),而白藜蘆醇干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)(p0.05)。細胞因子IL-1β和IL-18參與了炎癥的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)海馬IL-1β和IL-18的mRNA水平在卵巢切除后顯著增加(p0.05),而白藜蘆醇干預(yù)后,可以阻斷卵巢切除小鼠海馬中IL-1β和IL-18 mRNA的升高(p0.05)。神經(jīng)炎癥可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的凋亡,本研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除組小鼠海馬組織中凋亡相關(guān)的caspase-1 mRNA水平顯著高于對照組(p0.05),白藜蘆醇處理可阻斷卵巢切除組的小鼠海馬組織中caspase-1 mRNA的升高(p0.05)。(4)白藜蘆醇主要通過Sirt1介導(dǎo)其作用,研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除組小鼠海馬Sirt1的mRNA水平較對照組顯著降低(p0.05),白藜蘆醇干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(p0.05)。與熒光定量PCR結(jié)果一致,Western Blot檢測證實了上述變化(p0.01)。研究結(jié)論:(1)卵巢切除導(dǎo)致的雌激素水平下降可導(dǎo)致雌性小鼠出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為,白藜蘆醇處理可改善卵巢切除小鼠的行為學(xué)異常。(2)雌激素水平下降可顯著激活海馬小膠質(zhì)細胞,導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加、細胞因子IL-1β、IL-18及炎癥相關(guān)通路NLRP3炎性小體和NF-κB的顯著升高,白藜蘆醇處理可顯著抑制海馬小膠質(zhì)細胞的激活。(3)白藜蘆醇通過激活Sirt1通路抑制卵巢切除引起的小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文1.5 研究方法本實驗采用已報道的動物模型，成年雌性小鼠卵巢切除后恢復(fù) 7 天，給予為期 14天的白藜蘆醇藥物腹腔注射，對照組以同體積 DMSO 替代。首先，驗證了卵巢切除后的雌激素水平和體重的變化；通過圖 1-1 的行為學(xué)檢測，觀察小鼠的焦慮樣行為和抑郁樣行為變化；通過細胞增殖的特異性標志 BrdU 探索卵巢切除和白藜蘆醇對海馬區(qū)增殖細胞的影響；通過小膠質(zhì)細胞的特異性標志 Iba1 探索卵巢切除與白藜蘆醇對海馬炎癥的影響；并通過 qPCR 檢測了海馬區(qū)的 NLRP3 炎癥小體相關(guān)通路的 mRNA 的表達；同時，用蛋白印跡檢測來分析卵巢切除后對海馬區(qū) Sirt1 的表達的影響和白藜蘆醇的干預(yù)治療作用，闡明白藜蘆醇在卵巢切除模型中的作用機制。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2 實驗結(jié)果2.2.1 卵巢切除減低小鼠血清的雌激素和孕酮的水平和子宮重量采用酶聯(lián)免疫分析，我們檢測了卵巢切除后小鼠血清的雌激素和孕酮的水平。如圖 2-1 中所示，卵巢切除后小鼠的血清雌激素水平明顯下降（p<0.01，圖 2-1 A），同時孕酮水平也降低明顯 （p<0.01，圖 2-1 B）。卵巢切除術(shù)后的小鼠子宮，由于激素水平的下降，，其重量也比假手術(shù)組有所降低，說明子宮已經(jīng)萎縮(p<0.01，圖 2-1 C)。而白藜蘆醇治療對小鼠血清的雌激素和孕酮的水平和子宮重量均無明顯影響。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2650732