【摘要】：目的:肝纖維化是各種慢性刺激或病因所致的肝臟疾病早期共有的病理變化,是一種可逆性的肝損傷修復(fù)反應(yīng),已有研究證實肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。丹參素是丹參的水溶性有效成分,有著抗心血管、抗氧化、抑制血小板活化等多種藥理作用。已有許多研究表明丹參素對于慢性肝臟損傷具有較好的保護(hù)作用,大部分都集中于其抗氧化應(yīng)激作用及改善脂質(zhì)過氧化。然而,HSC作為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié),丹參素對其增殖與凋亡的影響及其機(jī)制方面的研究卻很少。因此本課題將通過建立四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型,主要從HSC功能的角度探討丹參素防治大鼠肝纖維化的作用及其機(jī)制。方法:將48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、CC14模型組、丹參素治療組(20mg/kg低劑量組,40mg/kg高劑量組),每組12只。除正常對照組外,其余三組分別每周兩次使用50%CCl4/橄欖油溶液灌胃(1ml·kg-1),持續(xù)8周,建立CCl4肝纖維化模型。丹參素治療組自造模起開始給藥,按其質(zhì)量每天一次分別腹腔注射丹參素氯化鈉溶液20mg/kg及40mg/kg,同時正常對照組及模型組每天一次給予等體積的氯化鈉注射液。8周后對所有大鼠進(jìn)行稱重并處死,腹主動脈取血制備血清,采集肝臟組織樣品,觀察大鼠肝臟形態(tài)并稱肝重。收集好的大鼠血清使用全自動生化分析儀檢測血清中肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平,肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)、層黏連蛋白(LN)和Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)水平,另外采用羥脯氨酸檢測試劑盒檢測血清中羥脯氨酸含量。多聚甲醛溶液(4%)固定肝臟組織并作組織病理學(xué)檢查(HE染色和VG染色);Western blot實驗檢測肝組織AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K1、p-p70S6K1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平;免疫熒光平行實驗考察大鼠肝組織中p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K1、p-MEK、p-ERK、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響;Real-time PCR檢測細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)降解、血管生成及調(diào)控因子(VEGF、β-FGF、PD-ECGF、MMP-13、TIMP-1、collagen I和collagen Ⅲ)、HSC激活因子(α-SMA,TGF-β,Desmin,Vimentin)及炎癥相關(guān)因子(Cox-2,IL-1,IL-6,TNF-α)的表達(dá);TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測HSC的凋亡情況。結(jié)果:50%CC14/橄欖油溶液(1ml·kg-1)灌胃8周后,模型組大鼠體重及肝臟指數(shù)相比對照組顯著升高(P0.05),丹參素給藥組中的大鼠體重和肝臟指數(shù)則不同程度的降低(P0.05)。血清檢測表明丹參素能劑量依賴性降低肝功能指標(biāo)(AST/ALT)水平和肝纖維化指標(biāo)(HA/CollagenIV/LN/PⅢNP)水平及羥脯氨酸含量(P0.05)。HE和VG病理組織染色顯示,丹參素能有效抑制肝纖維化病理進(jìn)程。相比模型組,治療組肝臟組織膠原沉積明顯減少,肝纖維化程度有所改善,并且隨著劑量增加,改善效果更好。Western blot實驗及免疫熒光平行實驗結(jié)果顯示,丹參素可抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K及MEK/ERK信號通路。p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-MEK及p-ERK蛋白表達(dá)在治療組呈劑量依賴性降低(P0.05),且各組中總AKT、mTOR、p70S6K、MEK、ERK含量水平基本保持不變。Western blot、Real-time PCR、TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測及免疫組化平行實驗顯示,丹參素可抑制HSC激活因子(α-SMA,TGF-β,Desmin,Vimentin)表達(dá)(P0.05),調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Bax,Cleaved caspase 3,Caspase-3)的表達(dá)水平(P0.05),從而抑制HSC活化并促進(jìn)其凋亡(P0.05)。Real-time PCR實驗顯示,丹參素可影響細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控因子(MMP-13,TIMP-1,Collagen I,CollagenⅢ)及肝竇毛細(xì)血管化調(diào)控相關(guān)因子(VEGF,β-FGF,PD-ECGF)的表達(dá)(P0.05),并降低炎癥相關(guān)因子(Cox-2,IL-1,IL-6,TNF-α)水平(P0.05),從而有效調(diào)節(jié)ECM降解并降低血管生成及肝組織中的炎癥浸潤。結(jié)論:丹參素可通過影響HSC功能抑制CC14誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化,并且其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR/p70S6K1及MEK/ERK信號途徑有關(guān)。
【圖文】：

１．３．２大鼠肝臟大體形態(tài)觀察逡逑對照組大鼠解剖后可見其肝組織顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，表面光滑＊邊緣銳利，逡逑呈常肝組織形態(tài)Ｃ圖１Ａ）邐與對照組相比，模型組大鼠肝組織體積明．顯增太，逡逑質(zhì)地脆１邋硬，組織表面粗糙，顆粒狀凸起較多１投有光澤，出現(xiàn)明顯的肝損傷狀逡逑態(tài)（圖１Ｂ）邋？丹參素治療組的肝組織較模型組狀態(tài)有所改善，低劑憊組肝組織逡逑表面依然存在細(xì)小顆粒，整體較柔軟（圖１Ｃ），禽劑量組肝組織顏色有光澤，逡逑較模型組及低劑：量姐表面光滑（圖１Ｄ）。逡逑Ａ邐邐邋Ｂ逡逑正常對照組邐ＣＣＩ４模型組逡逑（Ｎｏｒｍａｌ）邐（ＣＣＩ４邋ｍｏｄｅｌ）逡逑０邐Ｄ逡逑Ｔ逡逑Ｖ＾＞邐１１邋欰逡逑丹參素低劑量組邐丹參素高劑置組逡逑（ＣＣＩ４＋Ｔａｎｓｈｉｎｏｌ邋２０邋ｍｇ／ｋｇ）邐（ＣＣＩ４＋Ｔａｎｓｈｉｎｏｌ邋４０邋ｍｇ／ｋｇ）逡逑圖１各組大鼠肝臟大體形態(tài)觀察逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｆｅａｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｌｉｖｅｒｓ邋ｉｎ邋ｆｏｕｒ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑

模型組的大鼠體重均有明顯下降（Ｐ＜０．０５）；與ＣＣ１４模型組相比，，丹參素高、逡逑低劑量組的大鼠體重呈不同程度的增加（Ｐ＜0．0５），并且丹參素高劑量組的大鼠逡逑體重增加顯著（Ｐ＜０．０５）（圖２）。對于肝重及肝臟指數(shù)，ＣＣＵ模型組與正常對逡逑照組相比均都有明顯增加（Ｐ＜０．０５），丹參素高、低劑量組相比ＣＣ１４模型組有逡逑不同程度降低（Ｐ＜0．0５），且丹參素高劑量組的肝重及肝臟指數(shù)降低顯著（Ｐ＜０．０５）逡逑（圖邋２）。逡逑１０逡逑
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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