【摘要】：JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化等功能,在機(jī)體免疫應(yīng)答和癌癥發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。尋找調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物也是研究熱點之一。中草藥中含有的天然化合物,數(shù)目眾多,結(jié)構(gòu)各異。其中許多天然化合物被報道可以調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路,具有抗炎、抗腫瘤等活性,但是中草藥及其含有的天然化合物起效的分子機(jī)制卻未被完全揭示。因此,本論文的研究目的是從中草藥化學(xué)成分里尋找可以調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路的化合物以及探究其作用方式,并且深入探討中草藥治療人類疾病的可能分子機(jī)制。第一部分我們探討了天然產(chǎn)物衍生物P-13抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。利用STAT3調(diào)節(jié)依賴的熒光素酶報告基因篩選平臺,我們對中草藥植物天明精中的一系列天然分子及其衍生物進(jìn)行檢測,最終獲得一個活性很好的化合物P-13。P-13是天然分子PCL的衍生物,屬于倍半萜內(nèi)酯。我們發(fā)現(xiàn),P-13以劑量和時間依賴的方式抑制IL-6誘導(dǎo)以及組成型的STAT3活化。體外激酶活性分析表明P-13直接抑制JAK2激酶活性。P-13同時也抑制IFN-α誘導(dǎo)的JAK1和TYK2的激活,表明它是一個泛JAK激酶抑制劑。P-13對IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用能夠被還原劑二硫蘇糖醇或谷胱甘肽阻斷,這表明靶蛋白上的巰基和P-13中的α,β不飽和羰基間發(fā)生了反應(yīng)。我們進(jìn)一步用蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)以及計算機(jī)分子對接擬合方法,揭示了 P-13與JAK2的SH2結(jié)構(gòu)域中的C452位點共價結(jié)合。我們還探究了 P-13對JAK/STAT信號通路具有一定選擇性。此外,P-13在體外抑制許多腫瘤細(xì)胞系的生長并誘導(dǎo)其凋亡,比如乳腺癌細(xì)胞,結(jié)腸癌細(xì)胞等。特別是對那些表達(dá)組成型活化的STAT3的癌細(xì)胞系的生長抑制作用更明顯。它還能夠抑制裸鼠體內(nèi)的人源結(jié)腸癌細(xì)胞異種移植瘤的生長�？傊�,我們的實驗結(jié)果揭示了天然產(chǎn)物衍生物P-13是一個含有邁克爾受體(α,β不飽和羰基)的JAK2的新型共價抑制劑,并且是一個有希望的抗癌候選化合物。第二部分我們對中草藥中普遍存在的、含有邁克爾受體(α,β不飽和羰基)的共價鍵化合物能否在半衰期較長的靶點蛋白上進(jìn)行共價累積,從而治療疾病的機(jī)制進(jìn)行了探索。我們首先將8000多種天然植物,49種傳統(tǒng)清熱抗炎中草藥植物以及21種經(jīng)典抗炎中藥方劑中含有的化合物,按照是否有α,β不飽和羰基結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類。我們發(fā)現(xiàn),含有該類結(jié)構(gòu)的化合物約占所有天然植物中化合物的1/3;占清熱抗炎中草藥中化合物的1/5;占經(jīng)典抗炎方劑中總化合物的1/4。幾乎所有的方劑都含有該類化合物。說明共價鍵化合物在自然界以及在中藥中普遍存在。我們利用炔基標(biāo)記的含有α,β不飽和羰基的天然產(chǎn)物衍生物P-alk作為探針,通過CuAAC反應(yīng),來探究P-alk和不同蛋白的相互作用時間以及累積效應(yīng)。在體外,我們發(fā)現(xiàn),P-alk和蛋白的相互作用時間較短且差異較小。P-alk具有體積和重復(fù)給藥累積效應(yīng)。在體內(nèi),P-alk經(jīng)過灌胃給藥后,主要富集于肝臟中。在不同組織中,P-alk和蛋白間的相互作用時間不同。在肝臟中,雖然大部分蛋白和P-alk的相互作用時間較短,但是仍然有少數(shù)蛋白和P-alk的相互作用時間較長,例如和肝炎緊密相關(guān)的JAK2蛋白。我們發(fā)現(xiàn)P-alk能夠劑量依賴地逆轉(zhuǎn)ConA誘導(dǎo)的肝損傷。最后,我們以單次沒有療效的較低劑量P-alk進(jìn)行重復(fù)給藥,P-alk能夠在肝臟JAK2蛋白上累積并逆轉(zhuǎn)ConA誘導(dǎo)的肝損傷。因此,我們的研究結(jié)果揭示中草藥中普遍含有α,β不飽和羰基的共價鍵化合物,能夠在半衰期較長的靶點上,通過較低劑量重復(fù)給藥進(jìn)行累積。總之,我們的研究從分子水平揭示了中草藥治療人類疾病的一種新機(jī)制-共價累積。這項研究也給人們更好地開發(fā)利用中草藥資源提供了新的理論指導(dǎo)。
【圖文】：

7 個成員（STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6 個保守結(jié)構(gòu)域（圖 1.2）10，并且每個結(jié)構(gòu)域的功能各不相同。從次為：(1) N 端結(jié)構(gòu)，它可以穩(wěn)定 STAT 蛋白二聚體。(2) 卷曲螺旋調(diào)節(jié) STAT 蛋白和別的蛋白之間相互作用。(3) DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域-binding domain, DBD），它直接調(diào)節(jié) STAT 蛋白和 DNA 分子之間) 接頭結(jié)構(gòu)區(qū)，它用來連接 DNA 結(jié)合域和 SH2 結(jié)構(gòu)域，但是它的還沒有被完全揭示。(5) SH2 結(jié)構(gòu)域，它對 STAT 蛋白和受體間的T 之間二聚化的形成非常重要。(6) 轉(zhuǎn)錄激活域（Transactivation d，，它主要調(diào)節(jié) STAT 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。該結(jié)構(gòu)域促進(jìn) STAT 蛋白和某間的相互作用，從而增強(qiáng) STAT 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。STAT 蛋白未被單體形式存在；激活后，STAT 蛋白形成胡桃夾子狀結(jié)構(gòu)的二聚體核進(jìn)行相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。因而，作為“胡桃夾子”鉸鏈的高度保守的也成為目前大多數(shù) STAT 抑制劑的主要靶向位置12。

一個 JAK 蛋白的 JH2 假激酶區(qū)直接結(jié)合其自身的 JH1 激抑制。在反式模型中，一個 JAK 蛋白的 JH2 假激酶區(qū)會白的 JH1 激酶區(qū)結(jié)合，互相抑制對方的激酶活性。在細(xì)由于受體的二聚化造成受體構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致連接在受離。最終使兩個 JAK 蛋白的 JH1 激酶區(qū)互相靠近，互相 JAK 激酶進(jìn)一步磷酸化相連受體上的酪氨酸位點，這些質(zhì)中 STAT 蛋白的停靠位點，招募 STAT 蛋白16。STAT 蛋上磷酸酪氨酸位點相連之后，得以靠近 JAK 激酶，從而化其相應(yīng)的酪氨酸位點而激活。磷酸化 STAT 蛋白通過 S細(xì)胞核進(jìn)行相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄17, 18。在哺乳動物中，能被 細(xì)胞存活的因子如 B-細(xì)胞淋巴瘤 2（BCL-2）家族蛋白，周期蛋白 cyclin D 等。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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