【摘要】：肝臟是酒精代謝的主要器官,酒精代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量有害物質(zhì),造成肝臟損傷。從食藥用菌中尋找天然活性物質(zhì)是預(yù)防和治療酒精肝損傷的一個(gè)研究熱點(diǎn)。黑木耳是我國傳統(tǒng)的食藥用菌,具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和多種生物活性。黑木耳中含有大量的黑色素,然而關(guān)于黑木耳黑色素的體內(nèi)生物活性研究卻鮮有報(bào)道,這在很大程度上限制了這種天然色素的應(yīng)用。為促進(jìn)黑木耳黑色素的開發(fā)利用,本文對黑木耳黑色素進(jìn)行了鑒定并探究了其纖維素酶-超聲波協(xié)同提取工藝,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探究了黑木耳黑色素對酒精肝損傷的干預(yù)作用及初步藥理作用機(jī)制。本文具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)通過紫外-可見光譜、紅外光譜、元素分析、凝膠滲透色譜、以及核磁共振氫譜對黑木耳黑色素進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,在此基礎(chǔ)上,探究了黑木耳黑色素的纖維素酶-超聲波協(xié)同提取工藝。結(jié)果表明,黑木耳黑色素屬于真黑色素,平均分子量為48.99 kDa,最大吸收波長在215 nm,分子中具有吲哚結(jié)構(gòu),符合黑色素的典型特征。纖維素酶-超聲波協(xié)同提取法可顯著提高黑木耳黑色素提取率,在最優(yōu)條件下,黑色素提取得率可達(dá)到10.48%,相比傳統(tǒng)的浸提法提取率提高了46.98%。(2)在細(xì)胞水平上探究黑木耳黑色素對酒精肝損傷的干預(yù)作用,采用MTT法檢測細(xì)胞活力,并通過測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和GSH(還原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)比值分析黑木耳黑色素對酒精引起的L02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黑木耳黑色素能顯著提高酒精預(yù)處理的L02肝細(xì)胞的存活率(p0.01),還能夠改善細(xì)胞形態(tài),降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p0.01),提高GSH/GSSG比值(p0.01)。(3)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對黑木耳黑色素干預(yù)酒精肝損傷的作用進(jìn)行研究。采用灌胃的方式給予小鼠酒精,建立肝損傷模型,通過血清與肝功能指標(biāo)的檢測、病理切片的觀察、以及測定相關(guān)抗氧化酶mRNA的表達(dá)來評價(jià)黑木耳黑色素對酒精肝損傷的治療和預(yù)防效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黑木耳黑色素對小鼠酒精肝損傷具有良好的預(yù)防和治療作用,能夠顯著降低小鼠ALT、AST和MDA水平,提高ADH、SOD、CAT水平(p0.01);黑木耳黑色素還能夠明顯改善酒精引起的小鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變;熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黑木耳黑色素能夠上調(diào)Nrf2及其下游的抗氧化酶mRNA的表達(dá)(p0.01)。本文明確了黑木耳黑色素對小鼠酒精肝損傷的治療與預(yù)防作用及其初步藥理作用機(jī)制,豐富了黑木耳黑色素的藥理藥效,為其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了新思路,同時(shí)本研究還為黑木耳黑色素的高效提取提供了新方法。
【圖文】：

研究技術(shù)路線

在最大波長下檢測吸光度，以氫氧化鈉溶液為空白，繪制了黑木耳黑色素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2-1）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中黑色素含量，，并根據(jù)公式 2-1 計(jì)算黑木耳黑色素提取率。(%) 100%黑木耳子實(shí)體粉末質(zhì)量提取液中黑色素質(zhì)量提取率（2-1）圖 2-1 黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1 Standard curve of melanin（2）酶解單因素試驗(yàn)在固定超聲條件（超聲溫度 30°C、超聲時(shí)間 30 min、超聲功率 250 W、料液比 1:30、NaOH 濃度 1.25 mol/L）的前提下，以黑色素提取率為指標(biāo)，分別考察了酶底比（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%和 1.8%）、酶解溫度（30、35、40、45、50 和 55°C）、酶解 pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 和 6.0）和酶解時(shí)間（20、40、60、80、100 和 120 min）對黑木耳黑色素提取率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。（3）酶解正交優(yōu)化對上述酶底比、酶解溫度、酶解 pH 以及酶解時(shí)間 4 個(gè)單因素進(jìn)行篩選，選出對黑色素提取率影響較大的 3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表 2-2。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2623457