【摘要】：α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor,α-AI)屬于糖苷水解酶抑制劑的一種,廣泛存在于各種植物種子、胚乳和微生物代謝產(chǎn)物中。α-淀粉酶抑制劑可特異性地抑制α-淀粉酶發(fā)生水解作用,阻礙食物中碳水化合物的水解,從而減少人體對(duì)糖分的攝取,可降低血糖、血脂指標(biāo),因此,可以作為防止和治療肥胖癥、脂肪過(guò)多癥、動(dòng)脈硬化癥、高血脂及糖尿病等疾病的有效藥物。羅漢果內(nèi)生菌(endophyticbacteria)普遍存在于健康羅漢果植物組織中,是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。大量研究表明內(nèi)生菌可產(chǎn)生與寄主相同或功能相似的活性物質(zhì)。羅漢果內(nèi)含有可顯著降低血糖的活性物質(zhì),其降糖活性可能通過(guò)基因插入或轉(zhuǎn)換到內(nèi)生菌中,使內(nèi)生菌具有與宿主相同或相似的降糖功能。因此,羅漢果內(nèi)生菌可作為降糖活性物質(zhì)(α-淀粉酶抑制劑)的篩選來(lái)源,且具有很大的潛力與開(kāi)發(fā)價(jià)值。本研究從羅漢果內(nèi)生菌中篩選出能高產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的內(nèi)生真菌,從菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出α-淀粉酶抑制劑,對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究,并對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化增加目標(biāo)產(chǎn)物的得率,目的是為α-淀粉酶抑制劑開(kāi)發(fā)為降糖、減肥藥物或保健食品等的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)為羅漢果內(nèi)生菌的其他開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù),主要完成內(nèi)容如下:1.羅漢果內(nèi)生菌的分離采用不同的表面消毒方案分別從羅漢果根、莖、葉和果實(shí)中分離得到內(nèi)生真菌各33、10、3、30株和內(nèi)生細(xì)菌各18、5、3、10株。2.產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑羅漢果內(nèi)生真菌的篩選采用打洞法和Bernfeld法篩選得到11株具有α-淀粉酶抑制活性的羅漢果內(nèi)生真菌,其中編號(hào)為PD-3、PD-4、P-3、P-8的4株內(nèi)生菌0.25 mL發(fā)酵原液對(duì)α-淀粉酶抑制率分別為47.96%、88.43%、57.74%和73.67%,抑制活性均高于1 mg·mL~(-1)的陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(45.78%),對(duì)4株菌株進(jìn)行活性部位追蹤得到它們的有效活性部位分別為乙酸乙酯相(PD-4、P-3、P-8)和正丁醇相(PD-3),抑制率測(cè)定結(jié)果顯示,菌株P(guān)D-4的乙酸乙酯相活性最高,當(dāng)有效相濃縮浸膏質(zhì)量濃度為1mg·mL~(-1)時(shí)抑制率高達(dá)99.46%,相當(dāng)于濃度為2.079mg·mL~(-1)阿卡波糖的抑制活性。對(duì)4株菌株有效相進(jìn)行化學(xué)成分分析研究發(fā)現(xiàn)具有α-淀粉酶抑制活性的成分可能為蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)和醌類(lèi)等化學(xué)成分。3.菌株P(guān)D-4產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化及分子生物學(xué)鑒定從五種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基篩選出PDB培養(yǎng)基作為菌株P(guān)D-4進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用單因素實(shí)驗(yàn)探討不同溫度、裝液量、接種量、初始pH值和發(fā)酵時(shí)間等對(duì)菌株產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的影響,最終選取溫度、初始pH值、裝液量和發(fā)酵時(shí)間等四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株P(guān)D-4產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑影響最顯著,最佳的發(fā)酵條件組合為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7,裝液量為200 mL(三角瓶容量500 mL),30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)8 d。最終通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)發(fā)酵液(0.25 mL)對(duì)α-淀粉酶抑制率為89.84%,較優(yōu)化前提高了1.41%。對(duì)菌株P(guān)D-4進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)菌株菌落正面為灰綠色,表面粗糙,由中間往外成環(huán)狀延伸生長(zhǎng);菌落背面呈淡黃色。顯微鏡觀察菌絲體無(wú)隔,菌絲頂部有分生孢子梗,孢子灰綠色呈卵圓形。為進(jìn)一步確定菌株P(guān)D-4的種屬,采用分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:菌株P(guān)D-4與Penicillium rolfsii屬有99%的相似性,為羅爾夫青霉。4.α-淀粉酶抑制劑活性成分的純化研究將菌株P(guān)D-4大量發(fā)酵,發(fā)酵液經(jīng)極性由小到大的有機(jī)溶劑萃取后得到活性最高的乙酸乙酯相。通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂和硅膠柱層析純化后,得到的純化物樣品浸膏在質(zhì)量濃度為0.3 mg·mL~(-1)時(shí)抑制率為87.18%,相當(dāng)于1.904 mg·mL~(-1)阿卡波糖的抑制率。通過(guò)對(duì)其理化性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),溫度和pH值對(duì)α-淀粉酶抑制劑的活性影響不大;而金屬離子的影響則隨著Na~+和Ca~(2+)離子濃度的升高,抑制率逐漸降低,Fe~(3+)和Mg~(2+)對(duì)抑制劑活性基本無(wú)影響,低濃度K~+(0.01 mg·mL~(-1))對(duì)抑制劑活性影響不大,濃度為0.5 mg·mL~(-1)時(shí)活性有所降低。經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),純化物樣品在250 nm波長(zhǎng)下,于20 min時(shí)有一單峰出現(xiàn),而得到的純化物仍有少許雜質(zhì)存在,無(wú)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,有待進(jìn)一步純化。經(jīng)化學(xué)成分分析初步確定其為黃酮類(lèi)物質(zhì)。
【圖文】：

圖 3-1 產(chǎn) α-淀粉酶抑制劑菌株打洞法篩選結(jié)果of strain strain producing alpha-amylase inhibi知，菌株 PD-4 和 P-8 透明圈最小，幾乎陽(yáng)性對(duì)照的阿卡波糖要小，說(shuō)明這四種菌 Bernfeld 法篩選結(jié)果法篩選出的 11 種羅漢果內(nèi)生真菌進(jìn)行抑，菌株 PD-4 發(fā)酵液對(duì) α-淀粉酶抑制活性7%，，菌株P(guān)-3與 PD-3 抑制活性也較高，分α-淀粉酶抑制率均比陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖高結(jié)果選取該四種菌株進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步的

22圖 3-2 產(chǎn) α-淀粉酶抑制劑活性菌株形態(tài)觀察結(jié)果菌落及細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖-2 Fungui colony and cell structure of active strain producing alpha-amylase inhibitoobserved性菌株菌絲體 α-淀粉酶抑制活性測(cè)定 3-3 可知，與陰性對(duì)照相比，菌株 PD-3、PD-4、P-3 與 P-8 的菌絲體水 α-淀粉酶無(wú)抑制活性。對(duì)比 3.3.2 說(shuō)明活性存在于發(fā)酵液中。
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R284

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2622561