【摘要】：目的通過觀察補(bǔ)肺益腎方對香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor,NF)-κB信號通路相關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平的影響,探討補(bǔ)肺益腎方抑制CSE誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。方法將MRC-5細(xì)胞分為空白組(Control)、補(bǔ)肺益腎組(Bufei Yishen group,BY)、氨茶堿組(aminophylline group,Am)、CSE組、CSE+BY組、CSE+Am組、si RNA組、si RNA+BY組、si RNA+Am組、si RNA+CSE組、si RNA+CSE+BY組和si RNA+CSE+Am組,采用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein discrete succinimide ester,CFSE)法標(biāo)記,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞增殖情況,Annexin V-FITC聯(lián)合PI標(biāo)記,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況,采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-8、TNF-α、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、FN、LN、COL-I、COL-III和COL-IV的水平,采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測各組MRC-5細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá),采用熒光定量PCR技術(shù),檢測MRC-5 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、NF-κB p65和I-κBαm RNA表達(dá)水平,采用Western-Bloting技術(shù)測定MRC-5細(xì)胞中NF-κB p65和I-κBα的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1細(xì)胞增殖與Control組比較,BY和Am組細(xì)胞增值率均有所升高(P0.05),而CSE組明顯降低(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組有所升高(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+BY和si RNA+Am組均升高(P0.05),而si RNA+CSE組降低(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組有所下降(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NF-κB p65si RNA組與non-NF-κB p65組比較,si RNA+CSE+BY組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其它組均升高(P0.05)。2細(xì)胞凋亡與Control組比較,BY組細(xì)胞凋亡率有所降低(P0.05),Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而CSE組明顯升高(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組有所降低(P0.05);CSE+BY比CSE+Am組降低更多(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+BY和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而si RNA+CSE組升高(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較均降低(P0.05)。3 IL-1β、IL-8、TNF-α、TGF-β1與Control組比較,BY組、Am組和CSE組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-8、TNF-α和TGF-β1的水平均升高(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY組和CSE+Am組均降低(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較,IL-1β和IL-8降低更明顯(P0.05)而TNF-α和TGF-β1無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+BY、si RNA+Am和si RNA+CSE組均升高(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY與si RNA+CSE+Am組比較,IL-1β、IL-8和TNF-α降低更多(P0.05)而TGF-β1無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較均降低(P0.05)。4 MMP-9、TIMP-1與Control組比較,CSE組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9和TIMP-1均升高(P0.05),BY組和Am組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY組和CSE+Am組均降低(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+CSE組均升高(P0.05),si RNA+BY組和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY組和si RNA+CSE+Am組均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY與si RNA+CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較,MMP-9降低(P0.05)而TIMP-1無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5細(xì)胞外基質(zhì)與Control組比較,CSE組細(xì)胞培養(yǎng)液中FN、LN、COL-I、COL-III和COL-IV均升高(P0.05),BY組和Am組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY組均降低(P0.05),CSE+Am組COL-I、COL-III和COL-IV均降低(P0.05)而FN、LN無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較,FN和LN降低(P0.05),COL-I、COL-III和COL-IV無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+CSE組升高(P0.05),si RNA+BY組和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY組降低(P0.05),si RNA+CSE+Am組COL-I、COL-III和COL-IV降低(P0.05),FN和LN無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);si RNA+CSE+BY與si RNA+CSE+Am組比較,FN和LN降低(P0.05)而COL-I、COL-III和COL-IV無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NF-κB p65si RNA組與non-NF-κB p65組比較均降低(P0.05)。6α-SMA與Control組比較,CSE組α-SMA表達(dá)升高(P0.05),BY和Am組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組降低(P0.05);CSE+Am比CSE+BY組降低(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+CSE組表達(dá)升高(P0.05),si RNA+BY和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組降低(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較,si RNA+CSE組、si RNA+CSE+BY組和si RNA+CSE+Am組Am組均減少(P0.05),其它組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7 IL-1β、TNF-α和TGF-β1 m RNA與Control組比較,BY、Am組和CSE組細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和TGF-β1 m RNA的表達(dá)均升高(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組均降低(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較,IL-1β升高(P0.05)而TNF-α和TGF-β1 m RNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+BY、si RNA+Am組和si RNA+CSE組均升高(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY與si RNA+CSE+Am組比較,IL-1β和TNF-αm RNA降低(P0.05)而TGF-β1 m RNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較均降低(P0.05)。8 NF-κB p65和I-κBαm RNA與Control組比較,CSE組細(xì)胞中NF-κB p65和I-κBαm RNA表達(dá)均升高(P0.05),BY和Am組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組均降低(P0.05);CSE+BY與CSE+Am組比較均降低(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+CSE組均升高(P0.05),si RNA+BY和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am組均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY與si RNA+CSE+Am組比較均降低(P0.05);NF-κB p65 si RNA組與non-NF-κB p65組比較,NF-κB p65均降低(P0.05)而I-κBαm RNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9 NF-κB p65和I-κBα蛋白與Control組比較,BY和Am組細(xì)胞中NF-κB p65和I-κBα蛋白均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而CSE組升高(P0.05);與CSE組比較,CSE+BY和CSE+Am組有所降低(P0.05);CSE+BY比CSE+Am組降低更多(P0.05);與si RNA組比較,si RNA+BY和si RNA+Am組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而si RNA+CSE組升高(P0.05);與si RNA+CSE組比較,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am有所降低(P0.05);si RNA+CSE+BY比si RNA+CSE+Am組降低更多(P0.05)。si RNA與Control組,si RNA+BY與BY組,si RNA+Am與Am組,si RNA+CSE與CSE組,si RNA+CSE+BY與CSE+BY組,si RNA+CSE+Am與CSE+Am組比較細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)均降低(P0.05)而I-κBα蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10指標(biāo)的相關(guān)性分析經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn),呈高度相關(guān)程度(相關(guān)系數(shù)r"g0.8)以上的有:NF-κB p65與IL-1β(r=0.934,P=0.000)、IL-8(r=0.942,P=0.000)、TNF-α(r=0.926,P=0.000)、TGF-β1(r=0.938,P=0.000)、MMP-9(r=0.932,P=0.000)、FN(r=0.903,P=0.000)、LN(r=0.877,P=0.000)、COL-I(r=0.928,P=0.000)、COL-III(r=0.980,P=0.000)、COL-IV(r=0.915,P=0.000)、α-SMA(r=0.861,P=0.000)和NF-κB p65 m RNA(r=0.950,P=0.000);MMP-9與TIMP-1(r=0.857,P=0.000)、FN(r=0.823,P=0.001)、LN(r=0.842,P=0.001)、COL-I(r=0.986,P=0.000)、COL-III(r=0.963,P=0.000)、COL-IV(r=0.949,P=0.000);TIMP-1與LN(r=0.893,P=0.000)、COL-I(r=0.914,P=0.000)、COL-III(r=0.806,P=0.002)、COL-IV(r=0.937,P=0.000);IL-1β與IL-1βm RNA(r=0.935,P=0.000);TNF-α與TNF-αm RNA(r=0.910,P=0.000);TGF-β1與TGF-β1 m RNA(r=0.823,P=0.001);I-κBα與I-κBαm RNA(r=0.971,P=0.000)。結(jié)論1 NF-κB p65 si RNA的轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌有明顯抑制作用。2補(bǔ)肺益腎方能夠有效促進(jìn)CSE誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,降低炎癥細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,減少細(xì)胞轉(zhuǎn)化,其機(jī)制可能通過下調(diào)NF-κB通路抑制CSE誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞炎癥反應(yīng),降低氣道慢性炎癥的進(jìn)程,進(jìn)而延緩COPD氣道重塑。3單一因素刺激的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能完全模擬體內(nèi)的病理情況,進(jìn)一步研究時(shí)可以選取不同濃度的CSE或細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。
【圖文】：

圖 1 各組細(xì)胞增殖率的比較（—χ ±s）與 Control 組比較，▲P<0.05；與 CSE 組比較，，★P<0.05；CSE+Am 與 CSE+BY 組0.05；與 siRNA 組比較，■P<0.05；與 siRNA+CSE 組比較，●P<0.05；siRNA+CSiRNA+CSE+BY 組比較，%糚<0.05；non-NF-κB p65 與 NF-κB p65 siRNA 組比較，#P<RC-5 細(xì)胞凋亡率的比較與 Control 組比較，BY 組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），Am 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)>0.05），而 CSE 組明顯升高（P<0.05）；與 CSE 組比較，CSE+BY 和 CSE所降低（P<0.05）；CSE+BY 比 CSE+Am 組降低更多（P<0.05）；與 s較，siRNA+BY 和 siRNA+Am 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而 siRNA+C（P<0.05）；與 siRNA+CSE 組比較，siRNA+CSE+BY、siRNA+CSE+A學(xué)差異（P>0.05）；siRNA+CSE+BY 和 siRNA+CSE+Am 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)>0.05）。NF-κB p65 siRNA 組與 non-NF-κB p65 組比較均降低（P<0.05）

各組細(xì)胞凋亡率的比較（—χ±s）
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2619879