【摘要】：山茱萸(Cornus officinalis)為山茱萸科(Cornaceae)山茱萸屬(Cornus)落葉喬木或灌木,以干燥果皮入藥,具有補益肝腎、調(diào)節(jié)免疫和補氣固虛等作用。山茱萸的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物(CIGs),如馬錢苷和莫諾苷等,在神經(jīng)保護、治療糖尿病、腎病、阻止炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等方面具有良好的藥用價值。燈臺樹(Cornus controversa)與山茱萸親緣關(guān)系近,常被作為園藝觀賞植物,有藥用記載,但有關(guān)燈臺樹入藥及其成分的報道很少。目前,有關(guān)山茱萸屬植物的研究主要集中在種質(zhì)資源、優(yōu)良品種選育及栽培、生理和遺傳多樣性等方面,基因組數(shù)據(jù)和分子水平上的研究還沒有相關(guān)報道,尤其是藥用活性成分馬錢苷的合成和積累機制尚不清楚。近年來,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用十分廣泛,通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以快速獲得物種的基因信息數(shù)據(jù),為藥用活性成分的合成途徑、基因克隆和表達等研究奠定基礎(chǔ)。本論文選擇山茱萸和燈臺樹為實驗材料,通過觀察兩個物種果實生長期的種質(zhì)特性,比較分析種間總糖、總有機酸、總環(huán)烯醚萜苷和馬錢苷含量,采用高通量測序技術(shù)建立山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,克隆兩個物種馬錢苷合成途徑中的關(guān)鍵基因(G10H和SLS),并利用Real-time PCR檢測基因表達量,結(jié)合馬錢苷含量的動態(tài)變化,初步揭示藥用活性成分馬錢苷的合成機制和積累規(guī)律。主要結(jié)果如下:1.比較分析了生長期山茱萸和燈臺樹果實的種質(zhì)特性,研究發(fā)現(xiàn):山茱萸果的大小、百粒重和含水率都顯著高于燈臺樹(P0.05),僅出皮率略低于燈臺樹。山茱萸果實發(fā)育早期果核部分生長較快并骨質(zhì)變硬,到后期果肉部分顯著增加,推測主要是果肉代謝產(chǎn)物的積累。在兩個物種整個果實生長期中,果實大小、百粒重和出皮率均隨著果期延長逐漸增加,含水率相對比較穩(wěn)定。2.采用紫外分光光度計和高效液相色譜法等測定了山茱萸和燈臺樹不同時期不同部位中總糖、總有機酸、總環(huán)烯醚萜苷和馬錢苷含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):山茱萸果中各種成分的含量均高于葉和花,果實在成熟期各個含量均有顯著增加(P0.05);燈臺樹果中總糖和總環(huán)烯醚萜苷含量高于葉和花,總有機酸和馬錢苷含量均低于葉和花,果和葉隨著果實生長至成熟含量均降低;燈臺樹果中馬錢苷含量很低,極顯著低于山茱萸果(P0.01)。3.以山茱萸果皮為材料,采用高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得了44,718,948條clean reads,拼接組裝得到71,842條Unigene。將獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與多個數(shù)據(jù)庫進行比對,總共注釋到了 31,780條Unigene。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對,總共有9,978條Unigene映射到268個代謝通路中,其中,注釋到萜類化合物的合成途徑有105條,注釋到馬錢苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因約有16種(包括G10H和SLS等)。除此之外,采用MISA軟件篩選發(fā)掘了 13,719個SSR位點,通過NCBI中BlastX檢索與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對,總共獲得了 1,233條轉(zhuǎn)錄因子。4.根據(jù)山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到的基因序列,克隆了山茱萸和燈臺樹中G10H、SLS基因的保守區(qū)序列;采用同源克隆法克隆了燈臺樹中18S基因的保守區(qū)序列;并采用Real-time PCR測定了山茱萸和燈臺樹中G10H和SLS基因的表達量,結(jié)合兩個物種中馬錢苷的含量,初步分析表明G10H基因表達量與馬錢苷含量間存在正相關(guān)關(guān)系,SLS基因表達量與馬錢苷含量間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,但二者相關(guān)性均不顯著,推測可能與馬錢苷合成代謝途徑網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜,這兩個基因可能還參與了其它成分的合成。本研究比較了山茱萸和燈臺樹種間資源的性狀、藥用活性成分含量的差異等,通過山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了山茱萸和燈臺樹中馬錢苷合成途徑的關(guān)鍵基因,初步分析了馬錢苷合成途徑關(guān)鍵基因G10H和SLS的表達量與含量間的關(guān)系,為深入研究環(huán)烯醚萜苷類化合物合成和積累的分子機制奠定基礎(chǔ)。
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圖１－２馬錢苷合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｌｏｇａｎｉｎ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑１．２．４馬錢苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因逡逑香葉醇－１０－脫氫＜酶（ｇｅｒａｎｉｏ丨邋１０－ｈｙｄｒｏｘｙ丨ａｓｅ，Ｇ１０Ｈ）逡逑香葉醇－１０－脫氫酶被認(rèn)為是萜類化合物合成途徑中的調(diào)控酶［５６，５７］，屬于色素邋Ｐ４５０邋單氧酶（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ邋Ｐ４５０邋ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）家族中邋ＣＹＰ７６Ｂ邋亞家族成香葉醇－１０－脫氫酶能夠催化香葉醇（ｇｅｒａｎｉｄ）進行加羥基反應(yīng)，生成１０－羥基－醇（１０－ｈｙｄｒｏｘｙ＿ｇｅｒａｎｉｏｌ）邋［５８］。除此之外，該酶還參與植物黃酮類物質(zhì)的合成目前，，香葉醇－１０－脫氫酶編碼基因在長春花堿ｒｏｗＭ）和川西菜（５Ｗｒ心佊謂仿）中的獐牙菜苦苷等物質(zhì)合成過程中起著重要調(diào)節(jié)作用［６５逡逑

２．４．１山茱萸和燈臺樹果實形態(tài)比較逡逑山茱萸和燈臺樹的果實都是核果，核骨質(zhì)，但兩者的形態(tài)及大小差異很大（如逡逑圖２－１）。山茱萸果實和果核都是長橢圓形，果實早期是青綠色，并隨著生長發(fā)育逡逑逐漸變紅（如圖２－２），種子表面呈現(xiàn)淡黃色，有脈紋，略有突起，橫切面呈圓形，逡逑中心有一個圓形種仁，種皮較厚，有充滿棕黃色樹脂狀物質(zhì)的圓形腔室（如圖２－３）。逡逑燈臺樹果實和果核呈圓球形，深綠色，生長過程中顏色變化不大，成熟時顏色變逡逑深變黑，種子表面光滑，有明顯突起，中心有兩個種仁，種皮較厚（如圖２－３）。逡逑ＨＨＨＨｐ邋Ｈｉｔｔｍｉ逡逑？？＃＃＃＃？＃＃＃邐ｗ^歟礦饓嫛義賢跡玻鄙杰鏍嗆偷鋪ㄊ鞴低煎義獻ⅲ翰裳奔湮吩攏瓿咭恍「翊恚保恚礤義希疲椋紓澹玻卞澹疲潁酰椋簦簀澹錚駑澹茫澹錚媯媯椋悖椋睿幔歟椋簀澹幔睿溴澹茫澹悖錚睿簦潁錚觶澹潁螅徨義希危錚簦澹哄澹櫻幔恚穡歟椋睿玨澹簦椋恚邋澹椋簀澹剩酰歟�，邋ａ邋ｓｍａe戾澹螅悖幔歟邋澹潁澹穡潁澹螅澹睿簦簀澹保恚礤義希保插義

本文編號：2614986