【摘要】：目的本研究擬從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)相互印證,探討三七皂苷R1(Notoginsenoside R1,NR1)對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的防治作用。并以絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路為切入點(diǎn),探討NR1在細(xì)胞分子和基因水平上防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制,為AS的靶點(diǎn)治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、理論部分:回顧了AngⅡ與AS的研究進(jìn)展,深入分析AngⅡ介導(dǎo)的MAPK/NF-κB信號(hào)通路與AS的相關(guān)性,并結(jié)合中醫(yī)理論與NR1對心血管系統(tǒng)藥理作用研究概況,為探討NR1以MAPK/NF-κB信號(hào)通路作為治療靶點(diǎn)干預(yù)AS提供理論依據(jù)。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用AngⅡ誘導(dǎo)Apo E-/-小鼠AS模型的復(fù)制方法,即將含有AngⅡ1000ng/kg/min的ALZET滲透泵植入小鼠皮下誘導(dǎo)4周,聯(lián)合正常飲食。將Apo E-/-雄性小鼠40只,隨機(jī)分成2組,其中AngⅡ組(對照組),NR1干預(yù)AngⅡ組(給藥組)每組各20只。于造模第2天,給藥組予以NR1 25mg/kg每日腹腔注射,對照組每日腹腔注射與NR1等體積的生理鹽水。(1)于術(shù)前1周、術(shù)后1、2、4周測量小鼠體重,根據(jù)體重變化調(diào)整NR1腹腔注射劑量。(2)應(yīng)用Kent無創(chuàng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠血壓變化。(3)采用生化法檢測小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)水平。(4)采用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)檢測小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積及主動(dòng)脈根部和頭臂干單位壞死中心面積。(5)采用油紅O染色檢測小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)的脂質(zhì)沉積。(6)采用苦味酸-天狼猩紅(Picric Sirius red,PSR)染色檢測斑塊內(nèi)膠原纖維含量。(7)采用免疫熒光法檢測斑塊內(nèi)a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth musclea-actin,a-SMA)、CD68的表達(dá)。(8)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1b(interleukin-1 beta,IL-1b)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1,MCP-1)水平。(9)采用Real-Time PCR檢測分析血管炎癥相關(guān)基因(TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及血管細(xì)胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)的表達(dá)。(10)采用Western blot法檢測血管中IκB激酶復(fù)合物(inhibitor-κB kinase,IKK)、p-IKK、P65、p-P65、κB抑制蛋白(inhibitor ofκB,IκB)、p-IκB蛋白的表達(dá)。3、體外實(shí)驗(yàn):為探討NR1對AngⅡ通路本身的影響,我們選擇MOVAS細(xì)胞(小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞)作為NR1作用的載體。采用AngⅡ誘導(dǎo)MOVAS細(xì)胞建立平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖模型,模擬VSMC在AS中的作用。將Movas細(xì)胞分為四組(對照組、NR1組、AngⅡ組、AngⅡ+NR1組),予以AngⅡ刺激量5μM,NR1處理濃度50μM。(1)應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測各組細(xì)胞的增殖活性。(2)應(yīng)用5-溴脫氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)法檢測各組細(xì)胞增殖中DNA的合成情況。(3)應(yīng)用Transwell小室檢測各組細(xì)胞縱向遷移能力。(4)應(yīng)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞橫向遷移能力。(5)應(yīng)用Western blot法檢測AngⅡ組、AngⅡ+NR1組細(xì)胞血管緊張素Ⅱ1型受體angiotensin type 1 receptor(AT1R)、血管緊張素Ⅱ2型受體angiotensin type 2 receptor(AT2R)水平及MAPKs(ERK、JNK、P38MARK)通路的激活情況。結(jié)果1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):AngⅡ皮下誘導(dǎo)Apo E-/-小鼠4周,成功建立AS模型。(1)體重變化比較:兩組小鼠的體重在同時(shí)段比較無顯著性差異(P0.05)。(2)血壓比較:治療前兩組小鼠收縮壓(systolic blood pressure,SBP)水平相當(dāng)(P0.05),AngⅡ泵入后2周、4周SBP均明顯升高,但組間比較無明顯差異(P0.05)。(3)血脂指標(biāo)比較:治療前兩組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C無顯著差異(P0.05)。治療后:與同組比較,給藥組血清TG、LDL-C指標(biāo)有明顯改善(P0.01或P0.05);與對照組比較,給藥組在降低血清TG、LDL-C方面優(yōu)于對照組(P0.01)。(4)HE染色:與對照組比較,給藥組能顯著減少小鼠主動(dòng)脈根部的AS斑塊面積(P0.01),明顯減少主動(dòng)脈根部和頭臂干的單位壞死中心面積(P0.01)。(5)油紅O染色:與對照組相比,給藥組能顯著減少小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)的脂質(zhì)積聚(P0.05)。(6)PSR染色:與對照組比較,給藥組可顯著抑制斑塊內(nèi)膠原纖維的生成。(7)免疫熒光檢測:與對照組相比,給藥組可明顯降低小鼠主動(dòng)脈壁內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤;增加斑塊內(nèi)SMC的含量。(8)血清學(xué)指標(biāo):與對照組比較,給藥組血清學(xué)指標(biāo)TNF-a、IL-6、IL-1β和MCP-1均有改善(P0.05或P0.01)。(9)Real-Time PCR:與對照組相比,給藥組能顯著降低血管內(nèi)TNF-a、IL-6、IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 m RNA的表達(dá)(P0.01或P0.05)。(10)Western blot法:與對照組相比,給藥組能明顯上調(diào)IκB蛋白水平(P0.01);顯著抑制IKK和IκB的磷酸化(P0.01)。2、體外實(shí)驗(yàn):AngⅡ誘導(dǎo)Movas細(xì)胞成功建立VSMC增殖模型。(1)CCK-8實(shí)驗(yàn):與Control組相比,NR1組在450nm波長處不同時(shí)間段測得吸光值無明顯差異(P0.05);AngⅡ組隨著作用時(shí)間的延長(12-60h),其促增殖作用持續(xù)存在(P0.01)。當(dāng)AngⅡ+NR1作用12h時(shí),NR1抑增殖作用表現(xiàn)明顯,在12、24、48、60h吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)。(2)Brd U實(shí)驗(yàn):與Control組相比,NR1組在450nm波長處吸光度無明顯差異(P0.05);AngⅡ組吸光度明顯上升(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組吸光度顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3)Transwell實(shí)驗(yàn):與Control組相比,NR1組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P0.05);AngⅡ組穿過小室膜細(xì)胞數(shù)明顯增多(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ組+NR1組穿越小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):與Control組相比,NR1組細(xì)胞損傷愈合率無明顯差異(P0.05);AngⅡ組細(xì)胞愈合率明顯降低(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ組+NR1組細(xì)胞損傷修復(fù)率明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(5)Western blot法:與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組中AT1R水平明顯下調(diào)(P0.05),AT2R水平則無差異(P0.05)。與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組ERK、P38、JNK的磷酸化水平明顯受到明顯抑制(P0.01)。結(jié)論1.通過AngⅡ誘導(dǎo)Apo E-/-小鼠4周成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。2.三七皂苷R1抗AngⅡ誘導(dǎo)ApoE小鼠AS斑塊的效果明確。3.三七皂苷R1抗AS的作用與增加斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量、減少巨噬細(xì)胞聚集相關(guān)。4.三七皂苷R1具有降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂的作用,能通過降低AS的危險(xiǎn)因素而對疾病進(jìn)行防治。5.三七皂苷R1抗AS斑塊的效果不僅與降低循環(huán)中的炎癥因子水平相關(guān),而且還可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)Movas細(xì)胞的增殖和遷移,通過下調(diào)AT1R來抑制MAPKs(p-ERK、p-P38MARK、p-JNK)的激活,進(jìn)而抑制主動(dòng)脈壁組織中NF-κB信號(hào)通路的活化,下調(diào)其下游細(xì)胞因子(TNF-?、IL-6、IL-1β)、趨化因子(MCP-1)及黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的表達(dá),從而延緩AS的病理進(jìn)程。
【圖文】：

圖 1 兩組小鼠主動(dòng)脈根部可見斑塊形成（HE 染色，×40 倍）注：**P<0.01。3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化我們對兩組實(shí)驗(yàn)小鼠分別于 0 周（泵植入周）、泵后 1、2、4 周稱取體重，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P 值：表示兩組實(shí)驗(yàn)小鼠體重的比較。經(jīng)測量后統(tǒng)計(jì)，各周小鼠的體重 P 值均大于 0.05，即兩組實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中體重均有可比性。結(jié)果見表 1。表1 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠各階段的體重比較（g，x±S）組別 N 0 周 1 周 2 周 4 周對照組 17 28.50 2.25 29.81 2.48 30.21 2.37 29.50 3.55給藥組20 27.07 2.5328.29 2.6429.03 2.3228.79 2.55

給藥組在降低血清 TG、LDL-C 方面優(yōu)于對照組(P<0.01)。表明 NR1 抗 AS 的效果與調(diào)脂作用相關(guān)。結(jié)果見表 3、圖2-1，圖 2-2。表 3 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠治療前后血脂比較（mg/dl）組別 N TC TG LDL-C HDL-C對照組 17 治療前治療后9.74 1.348.98 1.051.25 0.401.22 0.360.65 0.220.65 0.060.19 0.050.15 0.06給藥組 20 治療前治療后9.41 1.828.69 2.521.20 0.340.91 0.13##**0.66 0.110.59 0.05#**0.18 0.070.15 0.08注：與同組治療前比較#P<0.05，##P<0.01；與對照組治療后比較**P<0.01。圖 2-1 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠治療前后 TG 比較注：與同組治療前比較##P<0.01；與對照組治療后比較**P<0.01。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2598008