【摘要】：目的本研究擬從體內(nèi)及體外實驗相互印證,探討三七皂苷R1(Notoginsenoside R1,NR1)對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導的載脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的防治作用。并以絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路為切入點,探討NR1在細胞分子和基因水平上防治動脈粥樣硬化的作用機制,為AS的靶點治療提供新的實驗依據(jù)。方法1、理論部分:回顧了AngⅡ與AS的研究進展,深入分析AngⅡ介導的MAPK/NF-κB信號通路與AS的相關性,并結合中醫(yī)理論與NR1對心血管系統(tǒng)藥理作用研究概況,為探討NR1以MAPK/NF-κB信號通路作為治療靶點干預AS提供理論依據(jù)。2、體內(nèi)實驗:采用AngⅡ誘導Apo E-/-小鼠AS模型的復制方法,即將含有AngⅡ1000ng/kg/min的ALZET滲透泵植入小鼠皮下誘導4周,聯(lián)合正常飲食。將Apo E-/-雄性小鼠40只,隨機分成2組,其中AngⅡ組(對照組),NR1干預AngⅡ組(給藥組)每組各20只。于造模第2天,給藥組予以NR1 25mg/kg每日腹腔注射,對照組每日腹腔注射與NR1等體積的生理鹽水。(1)于術前1周、術后1、2、4周測量小鼠體重,根據(jù)體重變化調(diào)整NR1腹腔注射劑量。(2)應用Kent無創(chuàng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠血壓變化。(3)采用生化法檢測小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)水平。(4)采用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)檢測小鼠主動脈根部斑塊面積及主動脈根部和頭臂干單位壞死中心面積。(5)采用油紅O染色檢測小鼠主動脈斑塊內(nèi)的脂質(zhì)沉積。(6)采用苦味酸-天狼猩紅(Picric Sirius red,PSR)染色檢測斑塊內(nèi)膠原纖維含量。(7)采用免疫熒光法檢測斑塊內(nèi)a-平滑肌肌動蛋白(smooth musclea-actin,a-SMA)、CD68的表達。(8)采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1b(interleukin-1 beta,IL-1b)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1,MCP-1)水平。(9)采用Real-Time PCR檢測分析血管炎癥相關基因(TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及血管細胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)的表達。(10)采用Western blot法檢測血管中IκB激酶復合物(inhibitor-κB kinase,IKK)、p-IKK、P65、p-P65、κB抑制蛋白(inhibitor ofκB,IκB)、p-IκB蛋白的表達。3、體外實驗:為探討NR1對AngⅡ通路本身的影響,我們選擇MOVAS細胞(小鼠主動脈平滑肌細胞)作為NR1作用的載體。采用AngⅡ誘導MOVAS細胞建立平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖模型,模擬VSMC在AS中的作用。將Movas細胞分為四組(對照組、NR1組、AngⅡ組、AngⅡ+NR1組),予以AngⅡ刺激量5μM,NR1處理濃度50μM。(1)應用細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測各組細胞的增殖活性。(2)應用5-溴脫氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)法檢測各組細胞增殖中DNA的合成情況。(3)應用Transwell小室檢測各組細胞縱向遷移能力。(4)應用劃痕愈合實驗檢測各組細胞橫向遷移能力。(5)應用Western blot法檢測AngⅡ組、AngⅡ+NR1組細胞血管緊張素Ⅱ1型受體angiotensin type 1 receptor(AT1R)、血管緊張素Ⅱ2型受體angiotensin type 2 receptor(AT2R)水平及MAPKs(ERK、JNK、P38MARK)通路的激活情況。結果1、體內(nèi)實驗:AngⅡ皮下誘導Apo E-/-小鼠4周,成功建立AS模型。(1)體重變化比較:兩組小鼠的體重在同時段比較無顯著性差異(P0.05)。(2)血壓比較:治療前兩組小鼠收縮壓(systolic blood pressure,SBP)水平相當(P0.05),AngⅡ泵入后2周、4周SBP均明顯升高,但組間比較無明顯差異(P0.05)。(3)血脂指標比較:治療前兩組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C無顯著差異(P0.05)。治療后:與同組比較,給藥組血清TG、LDL-C指標有明顯改善(P0.01或P0.05);與對照組比較,給藥組在降低血清TG、LDL-C方面優(yōu)于對照組(P0.01)。(4)HE染色:與對照組比較,給藥組能顯著減少小鼠主動脈根部的AS斑塊面積(P0.01),明顯減少主動脈根部和頭臂干的單位壞死中心面積(P0.01)。(5)油紅O染色:與對照組相比,給藥組能顯著減少小鼠主動脈斑塊內(nèi)的脂質(zhì)積聚(P0.05)。(6)PSR染色:與對照組比較,給藥組可顯著抑制斑塊內(nèi)膠原纖維的生成。(7)免疫熒光檢測:與對照組相比,給藥組可明顯降低小鼠主動脈壁內(nèi)巨噬細胞的浸潤;增加斑塊內(nèi)SMC的含量。(8)血清學指標:與對照組比較,給藥組血清學指標TNF-a、IL-6、IL-1β和MCP-1均有改善(P0.05或P0.01)。(9)Real-Time PCR:與對照組相比,給藥組能顯著降低血管內(nèi)TNF-a、IL-6、IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 m RNA的表達(P0.01或P0.05)。(10)Western blot法:與對照組相比,給藥組能明顯上調(diào)IκB蛋白水平(P0.01);顯著抑制IKK和IκB的磷酸化(P0.01)。2、體外實驗:AngⅡ誘導Movas細胞成功建立VSMC增殖模型。(1)CCK-8實驗:與Control組相比,NR1組在450nm波長處不同時間段測得吸光值無明顯差異(P0.05);AngⅡ組隨著作用時間的延長(12-60h),其促增殖作用持續(xù)存在(P0.01)。當AngⅡ+NR1作用12h時,NR1抑增殖作用表現(xiàn)明顯,在12、24、48、60h吸光度差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)。(2)Brd U實驗:與Control組相比,NR1組在450nm波長處吸光度無明顯差異(P0.05);AngⅡ組吸光度明顯上升(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組吸光度顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(3)Transwell實驗:與Control組相比,NR1組穿過小室膜的細胞數(shù)無明顯差異(P0.05);AngⅡ組穿過小室膜細胞數(shù)明顯增多(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ組+NR1組穿越小室膜的細胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(4)細胞劃痕實驗:與Control組相比,NR1組細胞損傷愈合率無明顯差異(P0.05);AngⅡ組細胞愈合率明顯降低(P0.01)。與AngⅡ組相比,AngⅡ組+NR1組細胞損傷修復率明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(5)Western blot法:與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組中AT1R水平明顯下調(diào)(P0.05),AT2R水平則無差異(P0.05)。與AngⅡ組相比,AngⅡ+NR1組ERK、P38、JNK的磷酸化水平明顯受到明顯抑制(P0.01)。結論1.通過AngⅡ誘導Apo E-/-小鼠4周成功建立動脈粥樣硬化模型。2.三七皂苷R1抗AngⅡ誘導ApoE小鼠AS斑塊的效果明確。3.三七皂苷R1抗AS的作用與增加斑塊內(nèi)平滑肌細胞含量、減少巨噬細胞聚集相關。4.三七皂苷R1具有降低動脈粥樣硬化小鼠血脂的作用,能通過降低AS的危險因素而對疾病進行防治。5.三七皂苷R1抗AS斑塊的效果不僅與降低循環(huán)中的炎癥因子水平相關,而且還可顯著抑制AngⅡ誘導Movas細胞的增殖和遷移,通過下調(diào)AT1R來抑制MAPKs(p-ERK、p-P38MARK、p-JNK)的激活,進而抑制主動脈壁組織中NF-κB信號通路的活化,下調(diào)其下游細胞因子(TNF-?、IL-6、IL-1β)、趨化因子(MCP-1)及黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的表達,從而延緩AS的病理進程。
【圖文】：

圖 1 兩組小鼠主動脈根部可見斑塊形成（HE 染色，×40 倍）注：**P<0.01。3.1.3 實驗動物體重變化我們對兩組實驗小鼠分別于 0 周（泵植入周）、泵后 1、2、4 周稱取體重，對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P 值：表示兩組實驗小鼠體重的比較。經(jīng)測量后統(tǒng)計，各周小鼠的體重 P 值均大于 0.05，即兩組實驗小鼠在實驗過程中體重均有可比性。結果見表 1。表1 兩組實驗小鼠各階段的體重比較（g，x±S）組別 N 0 周 1 周 2 周 4 周對照組 17 28.50 2.25 29.81 2.48 30.21 2.37 29.50 3.55給藥組20 27.07 2.5328.29 2.6429.03 2.3228.79 2.55

給藥組在降低血清 TG、LDL-C 方面優(yōu)于對照組(P<0.01)。表明 NR1 抗 AS 的效果與調(diào)脂作用相關。結果見表 3、圖2-1，圖 2-2。表 3 兩組實驗小鼠治療前后血脂比較（mg/dl）組別 N TC TG LDL-C HDL-C對照組 17 治療前治療后9.74 1.348.98 1.051.25 0.401.22 0.360.65 0.220.65 0.060.19 0.050.15 0.06給藥組 20 治療前治療后9.41 1.828.69 2.521.20 0.340.91 0.13##**0.66 0.110.59 0.05#**0.18 0.070.15 0.08注：與同組治療前比較#P<0.05，##P<0.01；與對照組治療后比較**P<0.01。圖 2-1 兩組實驗小鼠治療前后 TG 比較注：與同組治療前比較##P<0.01；與對照組治療后比較**P<0.01。
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2598008