【摘要】：目的:近年來,新興的化學(xué)生物學(xué)學(xué)科發(fā)展非常迅猛。該學(xué)科利用現(xiàn)有的數(shù)量龐大而且化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的小分子化合物庫,針對研究者所需要的化合物的生物活性進行篩選,并以此為依據(jù)進行相關(guān)的作用機制研究。本研究所選藥物為小白菊內(nèi)酯和大黃素,二者是從天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明顯的抗癌作用,尤其是腸腺癌,近年來的研究逐漸增多。因此,延續(xù)我們前期對小白菊內(nèi)酯和大黃素抗腸腺癌生物活性的研究,本課題采用體外實驗的方式,對小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)HCT-8/VCR細胞凋亡和耐藥逆轉(zhuǎn)作用機制靶點,以及大黃素誘導(dǎo)CACO-2細胞凋亡和調(diào)控PI3K/AKT信號通路的作用機制靶點進行了相關(guān)研究。通過對小白菊內(nèi)酯和大黃素抗癌活性及作用機制的研究,為天然植物藥物來源的小分子化合物抗癌作用提供基礎(chǔ),為天然植物藥物用于臨床腫瘤的治療開拓市場。后續(xù),我們將針對前期的研究成果,對兩種小分子化合物的生物活性與其結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進行分析,對于不理想的結(jié)構(gòu)進行修飾,為新的抗癌小分子藥物的研發(fā)做出貢獻。研究方法:一、小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)HCT-8/VCR細胞凋亡和耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究1、MTT法檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞的增殖抑制作用培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞株HCT-8、HCT-8/VCR細胞株,加入96孔板,實驗組加入不同濃度的PTL,對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液,處理12、24、48小時后,MTT法檢測各孔吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率。2、流式細胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡的影響。消化收集對照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8、HCT-8/VCR細胞,AnnexinV/FITC染色后,流式細胞儀檢測,分析細胞凋亡百分比。3、吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)熒光染色檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡的影響。取對數(shù)生長期HCT-8、HCT-8/VCR細胞,每孔1×10~4個/ml、2ml接種于6孔板中,孔內(nèi)放入蓋玻片。設(shè)小白菊內(nèi)酯濃度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及對照組共4組,每組3個復(fù)孔,每組給藥24h后,取出蓋玻片,固定、AO/EB染色、、封片,熒光顯微鏡觀察,每組分別計數(shù),每次計數(shù)細胞300個,計算凋亡率。4、Western-blot法檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞Bax、Bcl-2、蛋白表達的影響。收集對照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8、HCT-8/VCR細胞蛋白,用western blot方法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達。5、MTT法檢測PTL對HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用(1)取對數(shù)生長期HCT-8、HCT-8/VCR細胞,加入96孔板,分別加入不同濃度的VCR,處理24小時后,MTT法檢測HCT-8、HCT-8/VCR細胞VCR的半數(shù)抑制濃度,及HCT-8/VCR對VCR的耐藥指數(shù)。(2)取對數(shù)生長期HCT-8/VCR細胞,加入96孔板,分別設(shè)對照組、PTL5μmol/L、VCR(0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml)、PTL5μmol/L+VCR各濃度組,處理24小時后,MTT法檢測PTL對HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。6、流式細胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測PTL對HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。消化收集對照組、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml處理24h的HCT-8/VCR細胞,AnnexinV/FITC染色后,流式細胞儀檢測,分析細胞凋亡百分比。7、Western-blot法檢測PTL對HCT-8/VCR細胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表達的影響。收集HCT-8對照組、HCT-8/VCR對照組、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理24h的HCT-8/VCR細胞蛋白,用western blot方法檢測P-gp、MRP、GST-π蛋白的表達。二、大黃素誘導(dǎo)CACO-2細胞凋亡及對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用研究1、MTT法檢測大黃素對CACO-2細胞增殖抑制的影響對數(shù)生長期的CACO-2細胞,加入96孔板,實驗組加入不同濃度的PTL,對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液,處理24小時后,MTT法檢測各孔吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率。2、流式細胞術(shù)檢測大黃素對CACO-2細胞凋亡的影響。消化收集對數(shù)生長期的CACO-2細胞,以大黃素處理CACO-2細胞24h,終濃度分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式細胞儀檢測,分析細胞凋亡百分比。3、DAPI染色檢測大黃素對CACO-2細胞凋亡的影響取對數(shù)生長期CACO-2細胞,每孔1×104個/ml、2ml接種于6孔板中,孔內(nèi)放入蓋玻片。設(shè)大黃素濃度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及對照組共4組,每組3個復(fù)孔,,每組給藥24h后,取出蓋玻片,固定、DAPI染色、碳酸鹽緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察,激發(fā)波長為359 nm。觀察細胞凋亡情況。4、流式細胞術(shù)檢測大黃素對CACO-2細胞周期的影響取對數(shù)生長期的CACO-2細胞,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基制成2×104個/m1的單細胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔2ml,37℃培養(yǎng)12小時,更換培養(yǎng)液,加入藥物。大黃素物終濃度分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;對照組為加入完全培養(yǎng)基組,空白對照為只加入完全培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用胰酶消化細胞,調(diào)整細胞濃度為1x106個/ml,取0.25ml細胞,PBS清洗,1000rpm,4℃離心5分鐘,棄上清(重復(fù)兩次);將細胞重懸于0.25ml結(jié)合緩沖液中,取0.1ml細胞懸液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至終濃度50ug/ml,錫箔紙包住,避光4度染色30min,24h內(nèi)上機檢測。用流式細胞儀進行細胞周期檢測,重復(fù)實驗3次。5、Western-blot法檢測大黃素對CACO-2細胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達的影響收集對照組、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黃素處理24h的CACO-2細胞蛋白,用western blot方法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果:1、PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞的增殖抑制作用小白菊內(nèi)酯對結(jié)腸癌HCT-8、HCT-8/VCR細胞株有增殖抑制作用,并呈濃度及時間依賴關(guān)系,PTL12h半數(shù)抑制濃度IC50分別為20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半數(shù)抑制濃度IC50分別為15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半數(shù)抑制濃度IC50分別為11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡的影響。對照組HCT-8細胞凋亡率4.23%±0.75%,與對照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8細胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。對照組HCT-8/VCR細胞凋亡率4.42%±1.16%,與對照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8/VCR細胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述結(jié)果表明PTL以濃度依賴方式誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡。3、熒光染色檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡的影響熒光染色結(jié)果顯示,PTL以濃度依賴方式誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡。對照組HCT-8細胞凋亡細胞比率為10.33%±2.05%,與對照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8細胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。對照組HCT-8/VCR細胞凋亡細胞比率9.42%±1.25%,與對照組比較,經(jīng)5、10、20μmol/L的PTL處理24h后,HCT-8/VCR細胞的凋亡率顯著增加(p0.05),分別為18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法檢測PTL對HCT-8、HCT-8/VCR細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響。對照組HCT-8、HCT-8/VCR細胞可見Bax低表達,與對照組比較,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L組Bax表達顯著增加(p0.05)。對照組HCT-8、HCT-8/VCR細胞可見Bcl-2高表達,與對照組比較,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L組Bax表達顯著減少(p0.05)。上述結(jié)果表明,PTL通過以濃度依賴方式增加HCT-8、HCT-8/VCR細胞Bax的表達,降低Bcl-2的表達,誘導(dǎo)HCT-8、HCT-8/VCR細胞凋亡。5、MTT法檢測PTL對HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用(1)VCR對結(jié)腸癌HCT-8、HCT-8/VCR細胞株有增殖抑制作用(p0.05),并呈濃度依賴關(guān)系(p0.05),VCR半數(shù)抑制濃度IC50分別為2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR對VCR的耐藥指數(shù)為17.6倍。(2)VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml對HCT-8/VCR細胞無顯著增殖抑制作用(p0.05),VCR 6、10μg/ml對HCT-8/VCR細胞有輕度增殖抑制作用(p0.05),PTL5μmol/L與VCR(0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml)聯(lián)用可顯著增加VCR對HCT-8/VCR細胞的增殖抑制作用(p0.05)。聯(lián)用后VCR IC50為3.01±0.45μg/ml,與VCR單獨應(yīng)用時比較,IC50顯著降低(p0.05),PTL可顯著降低HCT-8/VCR對VCR的耐藥指數(shù)(p0.05)。上訴結(jié)果說明,PTL可顯著增加顯著增加VCR對HCT-8/VCR細胞的增殖抑制作用,逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR的耐藥。6、流式細胞儀(Annexin V-FITC/PI染色)檢測PTL對HCT-8/VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。Annexin V-FITC/PI染色檢測凋亡結(jié)果顯示,對照組細胞凋亡率5.01%±0.47%,經(jīng)VCR2μg/ml處理24h后,HCT-8/VCR細胞的凋亡率為6.93%±1.45%,與對照組比較,無顯著差異(p0.05),經(jīng)PTL5μmol/L處理24h后,HCT-8/VCR細胞的凋亡率為10.02%±0.86%,與對照組比較,凋亡率顯著增加(p0.05),PTL5μmol/L+VCR2μg/ml處理24h的HCT-8/VCR細胞凋亡率為34.7%±2.33%,與VCR2μg/ml組及PTL5μmol/L組比較,凋亡率均顯著性增加(p0.05)。結(jié)果表明,PTL可顯著增加VCR誘導(dǎo)HCT-8/VCR細胞凋亡能力,逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR細胞對VCR的耐藥。7、Western-blot法檢測PTL對HCT-8/VCR細胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表達的影響。western blot方法檢測結(jié)果顯示,HCT-8對照組可見P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表達;與HCT-8對照組比較,HCT-8/VCR對照組P-gp、MRP、GST-π蛋白表達顯著增加(p0.05);與HCT-8對照組比較,HCT-8/VCR對照組PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L處理HCT-8/VCR細胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表達顯著減少(p0.05),且PTL濃度越大蛋白表達越低。8、隨著大黃素濃度的逐漸提高,CACO-2細胞生存率逐漸降低,至200μmol/L,細胞生存率幾乎接近0。而大黃素對CACO-2細胞培養(yǎng)24h的IC 50值為30μmol/L。9、隨著大黃素濃度的逐漸升高,CACO-2細胞凋亡率也隨之升高,從對照組的1.85%,升至60μmol/L大黃素組的42.66%。大黃素對CACO-2細胞誘導(dǎo)凋亡的作用呈劑量依賴趨勢。10、30μmol/L和60μmol/L的大黃素干預(yù)后,細胞核明顯濃縮,染色加深,偶見核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊。尤其是60μmol/L的大黃素干預(yù)后,凋亡細胞核碎裂成大小不等的圓形小體,并被細胞膜所包繞,疑似凋亡小體。11、對照組細胞大部分處于G0/G1期,為62.3%,處于S期33.7%,處于G2/M期4.0%;大黃素干預(yù)后,細胞周期在G2/M期明顯發(fā)生停滯,該期細胞數(shù)顯著增多。并且隨著大黃素濃度的提高,停滯于G2/M期的細胞也逐漸增多。以60μmol/L的大黃素組G2/M細胞周期阻滯最為明顯。12、對照組細胞Bax呈低水平表達,而隨著大黃素濃度的增高,表達水平逐漸上調(diào);Bcl-2表達水平與Bax正好相反,對照組細胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表達,隨著大黃素濃度的增高,表達水平逐漸下調(diào)。而非磷酸化PI3K、AKT表達水平各組間無明顯差異。結(jié)論:1、小白菊內(nèi)酯對HCT-8、HCT-8/VCR細胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用,小白菊內(nèi)酯對結(jié)腸癌細胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用不受HCT-8/VCR細胞耐藥性的影響,小白菊內(nèi)酯可通過增加Bax的表達,降低Bcl-2的表達來誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡。2、小白菊內(nèi)酯可顯著增加VCR對HCT-8/VCR細胞的增殖抑制能力及凋亡誘導(dǎo)能力,小白菊內(nèi)酯對HCT-8/VCR細胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。其機制主要是通過PTL降低HCT-8/VCR細胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表達,逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR細胞的耐藥性。3、大黃素對CACO-2結(jié)腸癌細胞的生長具有明顯的抑制作用。其抗癌作用主要是由于誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯。此外,它還能抑制CACO-2細胞的PI3/AKT信號級聯(lián),提示大黃素在結(jié)腸癌治療中的潛在應(yīng)用。
【圖文】：

PTL 對 HCT-8 細胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)，PTL 對 HCT-8 細胞增殖抑間依賴關(guān)系。表 2 PTL 對 HCT-8/VCR 細胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)別 HCT-8/VCR（增殖抑制率%）μmol/L） 12h 24h 48h對照） 0.00 士 0.00 0.00 士 0. 00 0.00 士 05 12.84 士 2.11* 16.5 士 2.66* 28.80 士 210 26.37 士 1.87* 36.56 士 3.04* 46.22 士 215 40.13 士 2.96* 41.36 士 4.26* 58.45 士 420 46.43 士 3.45* 62.22 士 4.35* 75.51 士 240 67.75 士 1.66* 73.61 士 2.57* 83.72 士 2

TL 對 HCT-8/VCR 細胞增殖的影響(mean 士 SD,n=3)，PTL 對 HCT-8 細間依賴關(guān)系。 HCT-8、HCT-8/VCR 細胞凋亡的影響。胞儀檢測 PTL5μmol/L, 10μmol/L, 20μmol/L 對 HCT-8、HCT，統(tǒng)計凋亡率，重復(fù)實驗 3 次，結(jié)果以均數(shù)士標準差表示， HCT-8 細胞凋亡率 4.23%±0.75%，，與對照組比較，經(jīng) 5、10 24h 后，HCT-8 細胞的凋亡率顯著增加(p<0.05)，分別為 8.75% ， 38.16%±3.25% ， 見 圖 3 。 對 照 組 HCT-8/VCR 細6%，與對照組比較，經(jīng) 5、10、20μmol/L 的 PTL 處理 24h 后亡率顯著增加(p<0.05)，分別為 8.43%±0.95%，21.651%，見圖 4。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2596596