【摘要】：《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載,我國是世界上最早認(rèn)識并研究甘草的國家,甘草屬豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralesis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza infata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的根和根莖,又名甜草,是我國醫(yī)藥管理部門作為藥用植物而收載和管理的四大藥材之一,具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效,被廣泛應(yīng)用于臨床配方。藥理研究主要集中在甘草酸、甘草次酸、總黃酮、單種黃酮及多糖等化合物,其中甘草酸是甘草的主要藥效成分,其含量是我國2015年版《中國藥典》規(guī)定的含量測定項之一。研究表明,近年來栽培甘草普遍甘草酸含量較低,達(dá)不到2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重制約甘草資源的可持續(xù)發(fā)展和利用。因此,明確甘草中各成分代謝之間的調(diào)控關(guān)系,同時提高甘草中各藥用成分的含量,對提高甘草品質(zhì)有著非常重要的意義。已有研究表明,甘草酸生物合成途徑不是孤立存在的,它與其他次生代謝產(chǎn)物如脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途徑相互連接并構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),外源噴施適當(dāng)濃度的ABA能夠提高甘草中甘草酸的含量,9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCE)基因是 ABA 合成途徑中的限速酶基因之一,其表達(dá)量直接影響ABA的合成。即NCED基因是脫落酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因,其表達(dá)量的差異對ABA的積累有著顯著的影響,且外援噴施ABA及植物內(nèi)源ABA的含量差異均能促進(jìn)甘草酸的積累,即說明NCED基因表達(dá)量差異能夠影響甘草酸生物合成酶的活性,最終調(diào)控甘草酸合成量。本實驗室研究還將甘草NCEDs3個基因NCED1、NCED3及NCED4的SNPs位點分別與脫落酸及甘草酸含量進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析,根據(jù)結(jié)果初步認(rèn)定在NCED1、NCED3及NCED4三個基因中,NCED1基因變異位點對取樣時期ABA合成與積累總的作用要優(yōu)于NCED3、NCED4,但NCED3、NCED4兩個基因?qū)BA合成與積累也具有一定作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3個基因中NCED1基因437bp(GA)與甘草酸含量關(guān)聯(lián)系數(shù)最大,NCED3基因966bp(GA)和NCED4基因845bp(AG)次之,即認(rèn)為在進(jìn)行高甘草酸種質(zhì)的篩選時應(yīng)優(yōu)先考慮NCED1基因437bp處G型,NCED3基因966bp處G型以及NCED4基因966bp處A型。本實驗為在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗證以上的結(jié)論,比較研究調(diào)控甘草酸含量的功能基因NCED1、NCED3、NCED 分別過表達(dá)下甘草酸合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量、脫落酸和甘草酸的變化差異。本論文通過瞬時過表達(dá)方法,根據(jù)NCED1、NCED3、NCED4三個基因?qū)Ω什菟岷铣申P(guān)鍵酶基因表達(dá)量、脫落酸以及甘草酸含量的不同影響,篩選出NCEDs高效成員,為在分子調(diào)控水平上提高甘草酸含量和轉(zhuǎn)基因甘草研究提供理論依據(jù);同時構(gòu)建NCEDs原核表達(dá)體系,誘導(dǎo)出可溶性蛋白并純化,為實驗室今后進(jìn)一步在原核表達(dá)基礎(chǔ)上驗證NCEDs功能奠定了基礎(chǔ)。目前取得的主要成果如下:(1)從高甘草酸甘草植株中克隆出來NCEED1、NCED3、NCED4基因,連接pMD-19T克隆載體,成功轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,凍存于-80℃。(2)本文成功構(gòu)建根特異性通用表達(dá)載體并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建攜帶NCED1、CEED3和NCED4基因的根特異性表達(dá)載體采用T4連接酶連接的方法進(jìn)行根特異性通用表達(dá)載體的構(gòu)建,按照保護(hù)堿基的原則設(shè)計引物,將改造后的合成的TobRB7啟動子片段連接到載體pCAMBIA1305.1的Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ兩個酶切位點之間,并成功的轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。PCR驗證及測序驗證的結(jié)果均表明,根特異性通用表達(dá)載體pCA1305.1-7obRB7構(gòu)建成功。在根特異性通用表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,同樣采用T4連接酶連接的方法構(gòu)建攜帶NCED1、NCED3和NCED4基因的根特異性表達(dá)載體,引物設(shè)計原則同上,將NCED1、NCED3、NCED4基因片段分別連接到已經(jīng)構(gòu)建成功的根特異性通用表達(dá)載體pCA1305.1-TobRB7的Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ兩個酶切位點之間,并成功的轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。PCR驗證及測序驗證的結(jié)果均表明,表達(dá)載體pCAM-TToRB7-NCED1/3/4均構(gòu)建成功。(3)本文成功構(gòu)建甘草根特異表達(dá)工程菌采用電擊轉(zhuǎn)化法分別將根特異性表達(dá)載體pCA-TTbRB7-NCED1、pCA-TobRB7-NCED3和pCA-TobRB7-NCED4轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中,PCR驗證以及測序驗證的結(jié)果均表明載體已成功轉(zhuǎn)入,即EHA-TobRB7-NCED1、EHA-TobRB7-NCED3 和 EHA-TobRB7-NCED4 均構(gòu)建成功。(4)本文成功構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的NCEDs基因瞬時過表達(dá)體系本文利用種子吸收法構(gòu)建農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)體系,利用種子自然吸收農(nóng)桿菌重懸液來瞬時表達(dá)外源基因的方法,菌液侵染后,GUS染色結(jié)果表明,侵染5天后第一次出現(xiàn)藍(lán)色斑點,侵染14天后藍(lán)色斑點消失,未用農(nóng)桿菌侵染的甘草苗GUS染色未見藍(lán)色斑點,證明農(nóng)桿菌侵染成功。(5)對瞬時過表達(dá)后的甘草進(jìn)行甘草酸關(guān)鍵酶基因β-AS的表達(dá)量、脫落酸含量以及甘草酸含量的檢測以及差異分析本文利用熒光定量PCR的方法檢測工程菌EHA-TobRB7-NCED1、EHA-TobRB7-NCED3、EHA-TobRB7-1NCED4侵染后的甘草苗中的甘草酸關(guān)鍵酶基因β-AS的表達(dá)量變化,結(jié)果證明不同工程菌侵染的甘草和對照組甘草中β-AS基因表達(dá)量之間存在著顯著性差異(P0.05),未用工程菌處理的甘草組中β-AS基因表達(dá)量最低,工程菌處理后組后的β-AS基因表達(dá)量顯著提高,且提高程度為:EHA-TobRB7-NCED1EHA-TobRB7-NCED3EHA-TobRB7-NCED4。利用酶聯(lián)免疫方法分別測定工程菌EHA-TobRB7-NCE1/NCED3/NCED4侵染組甘草和未用工程菌侵染組甘草中的內(nèi)源脫落酸含量,結(jié)果表明,未用菌液侵染組甘草中內(nèi)源脫落酸含量最低,用工程菌EHA-TobRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染的甘草中,內(nèi)源脫落酸含量高低為:EHA-TobRB7-NCED1EHA-TobRB7-NCED3EHA-TobRB7-NCED4。利用HPLC分別測定工程菌EHA-TTbRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染組甘草和未用菌液侵染組甘草中的甘草酸含量,結(jié)果表明,未用菌液侵染組甘草中甘草酸含量最低,用工程菌EHA-TobRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染的甘草中,甘草酸含量高低為:EHA-TobRB7-NCED1EHA-TobRB7-NCED3EHA-TobRB7-NCED4。以上結(jié)果說明3個基因中NCED1基因序列437bp處G型的對本取樣時期內(nèi)β-AS基因表達(dá)量、內(nèi)源脫落酸和甘草酸合成與積累總的作用要優(yōu)于其他兩個基因,NCED3基因序列966bp處G型次之,NCED4基因序列845bp處A型最弱,但NCED3和NCED4對內(nèi)源脫落酸和甘草酸的合成與積累也具有一定的作用。所以在進(jìn)行甘草酸種質(zhì)篩選時或進(jìn)行轉(zhuǎn)基因甘草研究時應(yīng)優(yōu)先考慮的變異位點為NCED1基因序列437bp處G型,NCED3基因序列966bp處G型及NCED4基因序列845bp處A型。(6)首次成功誘導(dǎo)出NCED1、NCED4可溶性蛋白并成功純化,誘導(dǎo)出NCED3包涵體蛋白并成功純化本文在既往研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了誘導(dǎo)條件,利用優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件即0.2mM IPTG,16℃、過夜誘導(dǎo)含有 pET-30a(+)-NCED1/NCED3/3NCED4重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)菌株,使目的蛋白得到表達(dá),根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果分析可知,pET-30a(+)-NCED1和pET-30a(+)-NCED4誘導(dǎo)后表達(dá)出可溶性蛋白,而pET-30a(+)-NCED3誘導(dǎo)后表達(dá)為包涵體。利用不同濃度的咪唑?qū)φT導(dǎo)出的蛋白進(jìn)行純化,根據(jù)純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果分析可知,pET-30a(+)-NCED1和pET-30a(+)-NCED4誘導(dǎo)表達(dá)出的蛋白在咪唑濃度為300mM時洗脫產(chǎn)生較為純凈單一的蛋白條帶,之后選擇對濃度為300mM咪唑洗脫下來的溶液進(jìn)行超濾,超濾后的蛋白凍存。pET-30a(+)-NCED3誘導(dǎo)后表達(dá)為包涵體,經(jīng)過尿素復(fù)性后,在咪唑濃度為100mM時洗脫產(chǎn)生較為純凈單一的蛋白條帶,之后選擇對濃度為100mM咪唑洗脫下來的溶液進(jìn)行超濾,超濾后的蛋白凍存,為實驗室今后進(jìn)一步在原核表達(dá)基礎(chǔ)上驗證NCEDs功能奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ邋１：邋ＮＣＥＤ１邋２：邋ＮＣＥＤ３邋３：ＮＣＥＤ４）逡逑將陽性克隆菌液送上海生工生物工程服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果利用ＮＣＢＩ網(wǎng)站逡逑的ＢＬＡＳＴ功能在線比較該測序結(jié)果和其他物種的同源性，ＢＬＡＳＴ比對結(jié)果如圖３．２－３．４逡逑所示，由此可見，、ＭＵＭ基因克隆成功，得到重組質(zhì)粒ｐＭＤ－Ｍ：五￡＞八逡逑ｐＭＤ－ｉＶＣ￡Ｄ３、ｐＭＤ－ｉＶＣＥＺＸ。與實驗室前期成果篩選出的甘草植株利用ＤＮＡＭＡＮ進(jìn)行逡逑序列比對，如圖３．５－３．７所示，表明克隆得到的ｉＶＣ￡Ｚ）７基因序列４３７ｂｐ處為Ｇ型，ｉＶＣＥＭ逡逑基因序列９６６ｂｐ處為Ｇ型及ｉＶＣＥＺＭ基因序列８４５ｂｐ為Ａ型

（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ邋１：邋ＮＣＥＤ１邋２：邋ＮＣＥＤ３邋３：ＮＣＥＤ４）逡逑將陽性克隆菌液送上海生工生物工程服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果利用ＮＣＢＩ網(wǎng)站逡逑的ＢＬＡＳＴ功能在線比較該測序結(jié)果和其他物種的同源性，ＢＬＡＳＴ比對結(jié)果如圖３．２－３．４逡逑所示，由此可見，、ＭＵＭ基因克隆成功，，得到重組質(zhì)粒ｐＭＤ－Ｍ：五￡＞八逡逑ｐＭＤ－ｉＶＣ￡Ｄ３、ｐＭＤ－ｉＶＣＥＺＸ。與實驗室前期成果篩選出的甘草植株利用ＤＮＡＭＡＮ進(jìn)行逡逑序列比對，如圖３．５－３．７所示，表明克隆得到的ｉＶＣ￡Ｚ）７基因序列４３７ｂｐ處為Ｇ型，ｉＶＣＥＭ逡逑基因序列９６６ｂｐ處為Ｇ型及ｉＶＣＥＺＭ基因序列８４５ｂｐ為Ａ型
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284

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本文編號：2591671