發(fā)布時(shí)間：2020-03-18 08:27

【摘要】：惡性胸腔積液(malignantpleuraleffusion,MPE)是腫瘤晚期常見的并發(fā)癥,往往伴隨嚴(yán)重的癥狀,如呼吸困難、疼痛、惡病質(zhì)和體力減少等,且臨床預(yù)后差,中位生存期僅為3-12個(gè)月。MPE的臨床仍以姑息性治療為主,包括胸腔穿刺引流、胸膜固定術(shù)、胸膜腔內(nèi)化療藥物注射等,但多療效有限。近十年來MPE的病理生理機(jī)制研究有了重要進(jìn)展,揭示了 MPE形成的生物學(xué)過程。胸膜腫瘤可以干擾胸腔引流、宿主血管以及免疫系統(tǒng),導(dǎo)致胸膜腔液體吸收減少,滲出增多,從而促進(jìn)MPE的行程。在這一過程中,胸腔腫瘤血管生成、胸膜血管通透性增加、腫瘤生長和局部免疫炎性微環(huán)境發(fā)揮了重要作用。深入剖析MPE形成的生物學(xué)過程也為其臨床治療研究提供了新的方向。中藥消水方藥物由葶藶子、石韋、椒目、徐長卿、瓜萎、生黃芪、澤瀉、半枝蓮、靈芝、白術(shù)、大棗組成。全方具有健脾利水,扶正抗癌的功效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)中藥消水方聯(lián)合胸腔內(nèi)灌注順鉑治療惡性胸腔積液,可顯著減輕患者臨床癥狀,改善生存質(zhì)量�；A(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)中藥消水方可以減少小鼠胸腔惡性胸腔積液的形成,同時(shí)延長MPE模型小鼠的存活時(shí)間。機(jī)制研究提示中藥消水方對(duì)腫瘤細(xì)胞作用較弱,但對(duì)胸腔免疫細(xì)胞具有一定調(diào)控作用。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)消水方可以減少M(fèi)PE中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)的表達(dá)。M2型巨噬細(xì)胞是促進(jìn)MPE形成的關(guān)鍵因素,而TAMs自噬是調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的重要途徑。因此,我們提出消水方可能通過干預(yù)TAMs自噬,調(diào)控其表型極化,進(jìn)而減少M(fèi)PE的形成。研究目的通過觀察消水方對(duì)MPE中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬水平的影響,從調(diào)控巨噬細(xì)胞表型極化的角度揭示消水方抑制MPE形成的細(xì)胞分子機(jī)制,旨在闡釋消水方減少M(fèi)PE的科學(xué)內(nèi)涵,同時(shí)為進(jìn)一步應(yīng)用中醫(yī)藥治療MPE提供科學(xué)依據(jù)。研究方法1.采用胸腔注射小鼠來源的Lewis肺癌細(xì)胞的方法建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌胸腔積液模型,并比較不同Lewis細(xì)胞濃度對(duì)小鼠MPE模型的影響;2.通過小動(dòng)物活體成像等技術(shù)觀察中藥消水方對(duì)模型小鼠體重、胸腔積液、胸壁轉(zhuǎn)移瘤、胸腔腫瘤負(fù)荷以及生存期的影響;3.通過尾靜脈注射依文思藍(lán)染液、免疫組化檢測(cè)CD31/CD34表達(dá)以及Luminex檢測(cè)VEGF,觀察消水方對(duì)小鼠胸膜通透性及腫瘤血管新生的作用;4.通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD206、CD16/32表達(dá)和Luminex檢測(cè)IL-10、IL-12、TNFα表達(dá),從體內(nèi)及體外兩方面觀察消水方對(duì)巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控作用;5.通過Western blot檢測(cè)p62與LC3表達(dá)、MDC及LC3免疫熒光等方法從體內(nèi)及體外兩方面觀察消水方對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)控作用;6.通過自噬抑制劑及激動(dòng)劑驗(yàn)證消水方調(diào)控巨噬細(xì)胞表型與自噬的關(guān)系;7.通過體外誘導(dǎo)建立M1及M2型巨噬細(xì)胞,觀察消水方對(duì)M1型和M2型巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用;8.通過Western blot檢測(cè)消水方對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/mTOR/ULKl通路的影響。研究結(jié)果1.高濃度組(5.0×106cells/ml)小鼠成模率較高,10只小鼠有9只出現(xiàn)胸水,同時(shí)14天時(shí)小鼠胸水量平均796ul,胸腔內(nèi)有較多腫瘤組織,胸壁也有較多轉(zhuǎn)移瘤,平均14個(gè),相較于其他兩組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2.消水方組相比于對(duì)照組小鼠MPE體積明顯減少;但對(duì)胸壁轉(zhuǎn)移瘤消水方組與對(duì)照組無顯著差異;小動(dòng)物活體成像顯示消水方組3、7、10天各組熒光值無顯著差異,第14天消水方組小鼠胸腔熒光值稍低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;14天時(shí)消水方組小鼠體重明顯優(yōu)于順鉑組及模型對(duì)照組;相比于模型對(duì)照組,消水方組小鼠具有更長的生存期,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.消水方組胸水、外周血依文思藍(lán)濃度比值低于對(duì)照組,胸水VEGF表達(dá)水平也低于對(duì)照組,免疫組化顯示胸膜腫瘤CD31及CD34表達(dá)也低于模型對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.消水方組小鼠胸腔巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)降低,CD16/32表達(dá)增高,相比于對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;消水方組小鼠惡性胸腔積液IL-10表達(dá)降低,IL-12表達(dá)增高,TNF-α表達(dá)降低,相比于對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;體外共培養(yǎng)模型中,消水方組巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)降低,CD16/32表達(dá)增高,培養(yǎng)液上清中IL-10表達(dá)降低,IL-12表達(dá)增高,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5.消水方組小鼠胸水細(xì)胞p62蛋白表達(dá)降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高;消水方組小鼠胸膜腫瘤組織p62蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及LC3免疫熒光表達(dá)與對(duì)照組無差異;體外共培養(yǎng)模型中,消水方組巨噬細(xì)胞p62蛋白表達(dá)降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高,MDC免疫熒光值較對(duì)照組增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;6.消水方+雷帕霉素組巨噬細(xì)胞CD16/32表達(dá)增加,CD206表達(dá)降低;而消水方+3-MA組巨噬細(xì)胞CD16/32表達(dá)降低,CD206表達(dá)增加,相比于單用消水方組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;消水方+雷帕霉素組IL-10表達(dá)更低,差異具有意義,IL-12則無明顯差異;消水方+3MA組IL-10表達(dá)升高,IL-12表達(dá)降低,差異具有意義;7.Ml型巨噬細(xì)胞消水方組與對(duì)照組CD206、CD16/32以及培養(yǎng)液上清IL-10、IL-12表達(dá)均無差異;M2型巨噬細(xì)胞消水方組巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)降低,CD16/32表達(dá)增高,培養(yǎng)液上清中IL-10表達(dá)降低,IL-12表達(dá)增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;M1型巨噬細(xì)胞中,消水方組與對(duì)照組p62蛋白、LC3蛋白表達(dá)及MDC熒光值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,M2型巨噬細(xì)胞中,消水方組p62蛋白表達(dá)降低,LC3-LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高,MDC免疫熒光值較對(duì)照組增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;8.消水方組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞p-AMPK、p-ULKl(Ser555)表達(dá)升高,p-AKT、p-mTOR 及 p-ULKl(Ser757)的表達(dá)降低,AMPK、ULK1、mTOR 及 AKT表達(dá)無明顯差異。研究結(jié)論1.消水方可以抑制小鼠MPE生成,改善小鼠體重,延長小鼠生存期,但對(duì)胸腔腫瘤作用有限;其抑制MPE生成可能與降低胸膜通透性、抑制血管生成有關(guān);2.消水方可以通過上調(diào)TAMs自噬水平調(diào)控其表型極化,促使MPE中M2型TAMs向M1型轉(zhuǎn)化;3.消水方促進(jìn)自噬調(diào)控TAMs表型的作用可能與調(diào)控AMPK/mTOR/ULKl及PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)。
【圖文】：

邐中國中醫(yī)科學(xué)院２０１５級(jí)博士學(xué)位論文邐逡逑結(jié)構(gòu)域２邋（ＮＯＤ２）信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞自噬［２（）：１。近來研宄證實(shí)自噬對(duì)巨噬細(xì)逡逑胞具有重要調(diào)節(jié)作用［２１＿２３］。因此自噬，巨噻細(xì)胞和癌癥之間存在緊密的聯(lián)系，可逡逑以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的自噬來增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。鑒于巨噬細(xì)胞和自噻在腫瘤進(jìn)逡逑展中的重要作用及其在生物學(xué)活性中的相關(guān)性，有必要闡明自噬在調(diào)控的巨噬細(xì)逡逑胞中的作用及潛在分子機(jī)制。在下面的內(nèi)容中，我們將總結(jié)自噬在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞逡逑產(chǎn)生和極化中的重要性，，并討論自噬在調(diào)節(jié)ＴＡＭｓ的促進(jìn)腫瘤功能方面的作用。逡逑

于自嗔調(diào)控肺瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型極化探討消水方治療惡性胸腔積液的作用機(jī)近十余年來，由于動(dòng)物模型的改良，ＭＰＥ的機(jī)制研宄蓬勃發(fā)展，ＭＰＥ制由傳統(tǒng)的淋巴回流阻塞單因素轉(zhuǎn)向多因素共同作用。胸膜微環(huán)境中的（如胸膜間皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）以及髓源性、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞（如單核細(xì)粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）等與腫瘤細(xì)胞的相互作用，影響了腫瘤的、血管通透性增高和炎癥的發(fā)生等，最終導(dǎo)致ＭＰＥ的形成［６，７］（見圖１．２．１當(dāng)前ＭＴＯ現(xiàn)代機(jī)制的研宄進(jìn)展，學(xué)者們對(duì)中醫(yī)藥治療ＭＰＥ的具體機(jī)深入探討。從早期研究促胸膜粘連作用，到近來探討抑制血管生成及通的機(jī)制；從研宄調(diào)控機(jī)體免疫，到關(guān)注對(duì)局部免疫微環(huán)境的干預(yù)，中醫(yī)ＰＥ的機(jī)制研宄也經(jīng)歷由粗到細(xì)、由淺到深的過程。在這些研宄中，中現(xiàn)出一定的效果，同時(shí)也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療“多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)［３］
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2588494