【摘要】：目的:優(yōu)化蛋白質芯片技術同時定量檢測牛乳中β-Lg和Lf的檢測條件,建立相應的檢測方法,并對此檢測方法的應用進行評價。方法:基于雙抗體夾心法檢測抗原的原理,利用蛋白芯片對所選的β-Lg抗體、抗原和Lf抗體、抗原進行鼠單克隆抗體的篩選、探針種類的選擇、固定探針濃度與檢測抗體濃度組合、點樣一致性確定、封閉劑種類優(yōu)化、生物檢測限與檢測下限、S型曲線的建立與線性范圍的判斷、標準曲線與回歸方程的建立等實驗研究,優(yōu)化并確定了蛋白芯片技術同時檢測牛乳β-Lg與Lf的檢測條件。在檢測條件確定的基礎上對同時定量檢測兩種目標蛋白的蛋白芯片技術的準確度、精密度、方法學對照及檢測時效進行研究和評價。結果:鼠單克隆抗體篩選實驗結果證明所選β-Lg抗原、Lf抗原在芯片上能與各自相應的抗體結合,而β-Lg鼠單克隆抗體66#和Lf鼠單克隆抗體75#特異性最好。點樣探針優(yōu)化實驗證明β-Lg、Lf兩種蛋白的鼠單抗為固定探針時結果優(yōu)于兔多抗為探針時的結果。β-Lg固定探針與檢測抗體的濃度組合為:β-Lg鼠單克隆抗體66#的固定濃度為0.5 mg/mL,β-Lg兔多抗的檢測效價為1:2000;Lf固定探針與檢測抗體的濃度組合為:Lf鼠單克隆抗體75#的固定濃度為0.5 mg/mL,Lf兔多抗的檢測效價為1:2000。點樣一致性實驗顯示:為同時保證β-Lg鼠單克隆抗體66#和Lf鼠單克隆抗體75#兩種抗體理想的點樣效果,點制芯片時每次取樣后必須預點46點,同時預點后的點樣數(shù)應控制在44個點以內。選擇1%WB無蛋白封閉液作為封閉劑。β-Lg生物檢測限為33.52 ng/mL、檢測下限為5.41 ng/mL,Lf生物檢測限為3.60 ng/mL、檢測下限為0.96 ng/mL。β-Lg抗原濃度在134.06-4290.00 ng/mL范圍內與檢測信號值成線性關系,Lf抗原濃度在14.40-460.75 ng/mL范圍內與檢測信號值成線性關系,在線性范圍內選擇五點建立同時檢測兩種蛋白的標準曲線。β-Lg稀釋回收率在50.4%-112.7%之間、加標回收率在86%-107%之間,Lf稀釋回收率在106.5%-144.8%之間、加標回收率在83.7%-128.5%之間。蛋白芯片法同時檢測β-Lg和Lf的結果與ELISA法對兩種目標蛋白分別進行檢測的結果間無統(tǒng)計學差異,兩種方法檢測β-Lg和Lf的相關系數(shù)分別為0.743和0.773,并且相關系數(shù)具有統(tǒng)計學意義。β-Lg批內變異系數(shù)在7.6%-11.6%之間、批間變異系數(shù)在14.9%-33.5%之間,Lf批內變異系數(shù)在4.9%-14.2%之間、批間變異系數(shù)在24.8%-38.3%之間。完成抗原抗體反應后10天之內,蛋白芯片檢測樣品濃度之間無統(tǒng)計學差異。結論:優(yōu)化了用于牛乳β-Lg和Lf檢測的蛋白芯片檢測條件,從而建立了同時定量檢測牛乳β-Lg和Lf的蛋白芯片平臺。
【圖文】：

中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所碩士學位論文表１－３三株Ｌｆ鼠單抗與Ｌｆ結合的信號值比較逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋Ｌｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｏｎｏｃｌｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ邋ｒｅａｃｔｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋Ｌｆ邋（ｎ＝３，邋ｘ邋±邋Ｓ＇）逡逑組別邐Ｌｆ鼠單抗１＃邐Ｌｆ鼠單抗３５＃邐Ｌｆ鼠單抗７５＃Ｌｆ邋高抗原邐５７７６９±３０邐５２６０６±９０１３邐５７６７６邋土邋２９逡逑Ｌｆ邋低抗原邐６４０９７±３５邐３３５９５±６６５２邐３６３７５±４４７陰性對照組邐３５３７±４８３邋ｕ’２）邐８８０±５１５邐６３４±１６８注：（１）與Ｌｆ鼠單抗３５＃比較，尸＜０．邋０５；邋（２）與Ｌｆ鼠單抗７５＃比較，尸＜０．邋０

從兩種鼠單抗的點樣一致性掃描圖和點樣一致性分析圖中可以看出：點樣數(shù)逡逑在第４４？第９２點之間，（Ｂ邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃的點樣效果趨于一致。在第４３點和第逡逑９３點，（３邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃的信號強度均出現(xiàn)陡降（圖１－３、圖１－５）。但對于Ｌｆ逡逑鼠單抗７５＃來說，點樣數(shù)在第４７？第９０點之間，Ｌｆ鼠單抗７５＃的點樣效果趨于逡逑一致。在第４６點和第９１點，Ｌｆ鼠單抗７５＃的信號強度均出現(xiàn)陡降（圖１－４、逡逑圖邋１－５）。逡逑因此，為同時保證（３邋－Ｌｇ鼠單抗６６＃和Ｌｆ鼠單抗７５＃兩種抗體理想的點樣效逡逑果，，點制芯片時必須預點４６點，同時應保證單次沾樣后的點樣數(shù)應控制在４４逡逑個點以內。逡逑圖１－３邋（Ｊ－Ｌｇ鼠單抗６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）點樣一致性掃描圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ邋ｏｆ邋ｄｉｅ邋ｓｐｏｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｂｅ邋ｏｆ邋Ｐ－Ｌｇ邋６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）逡逑—Ｂ逡逑圖１－４邋Ｌｆ鼠單抗７５＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）點樣一致性掃描圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇ
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R155.5

【參考文獻】

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本文編號：2566771