本文關鍵詞：雷帕霉素對轉(zhuǎn)基因絨山羊細胞中外源基因表達的影響

  更多相關文章： 雷帕霉素 mTORC1 轉(zhuǎn)基因細胞系 Keratin5啟動子 IGF-1

【摘要】：雷帕霉素(rapamycin),又稱西莫羅斯,屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,在南太平洋復活節(jié)島(Easter Island, Rapa Nui)的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus AY B-994)代謝產(chǎn)物中獲得,起初被作為抗真菌藥物使用,后發(fā)現(xiàn)其具有強烈的免疫抑制作用而被用于治療器官移植的排斥反應。mTOR (mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素在哺乳動物中的靶蛋白,以nTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)和mTORC2(mammalian target of rapamycin complex 2)兩種蛋白質(zhì)復合體的形式存在,其中mTORCl對雷帕霉素敏感,而nTORC2對其不敏感,雷帕霉素是rnTORC1的特異性抑制劑。mTOC1通過下游效應蛋白4E-BP1和S6K1調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成,也參與基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。盡管對于mTOR信號通路功能的研究已較為深刻,但其對轉(zhuǎn)基因細胞系中外源基因表達的作用尚無報道。本實驗首先利用PCR技術克隆了人Keratin5啟動子,并通過構建啟動子功能驗證載體pK5-DsRed2-1,轉(zhuǎn)染絨山羊細胞,驗證人Keratin5啟動子的功能；其次,通過克隆絨山羊IGF-1基因,并連接到人Keratin5啟動子下游,構建皮膚特異性表達載體pCDsRed-KI,轉(zhuǎn)染細胞,構建轉(zhuǎn)基因細胞系；最后,利用雷帕霉素處理轉(zhuǎn)基因細胞,RT-PCR檢測外源基因表達。結果顯示：1)人Keratin5啟動子在絨山羊細胞中驅(qū)動標記基因表達并具有皮膚特異性；2)pCDsRed-KI在皮膚成纖維細胞中成功表達,通過篩選獲得了轉(zhuǎn)基因細胞系；3)用雷帕霉素處理轉(zhuǎn)基因細胞,可以抑制外源基因IGF-1得轉(zhuǎn)錄。上述結果表明mTOR信號通路對轉(zhuǎn)基因細胞中外源基因的表達可能具有調(diào)控作用。
【關鍵詞】：雷帕霉素 mTORC1 轉(zhuǎn)基因細胞系 Keratin5啟動子 IGF-1
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 縮略詞表9-10
• 第一章 文獻綜述10-20
• 1. 雷帕霉素與吸水鏈霉菌10
• 2. mTOR和mTOR信號通路10-13
• 3. 角蛋白及K5啟動子13-14
• 4. 胰島樣生長因子-1(IGF-1)14-16
• 參考文獻16-20
• 第二章 皮膚特異性人表皮角蛋白5基因啟動子克隆及表達載體構建20-32
• 1. 材料與方法20-27
• 1.1 材料20-21
• 1.2 人Keratin 5啟動子的克隆21-24
• 1.3 構建pK5-DsRed2-1載體并驗證Keratin 5啟動子的皮膚特異性表達特性24-27
• 2. 結果27-30
• 2.1 人Keratin5啟動子的克隆27-28
• 2.2 人Keratin5啟動子在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚成纖維細胞中特異性表達28-30
• 3. 討論30-31
• 參考文獻31-32
• 第三章 皮膚特異性表達IGF-1載體構建并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞32-42
• 1. 材料與方法32-36
• 1.1 質(zhì)粒、細胞系和菌株32
• 1.2 主要試劑及試驗材料32-33
• 1.3 內(nèi)蒙古絨山羊皮膚特異性表達IGF-1載體的構建33-35
• 1.4 表達載體pCDsRed2-KI轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞與胎兒成纖維細胞35-36
• 2. 結果36-41
• 2.1 皮膚特異性表達IGF-1載體的構建36-39
• 2.2 表達載體pCDsRed-KI穩(wěn)定轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古絨山羊皮膚成纖維細胞與胎兒成纖維細胞39-41
• 3. 討論41
• 參考文獻41-42
• 第四章 雷帕霉素對轉(zhuǎn)基因絨山羊細胞中外源基因表達的影響42-46
• 1. 材料與方法42-43
• 1.1 材料與試劑42
• 1.2 方法42-43
• 2. 結果43-45
• 3. 討論45
• 參考文獻45-46
• 結論46-47
• 附件47-48
• 致謝48-49
• 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的學術論文49

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