發(fā)布時(shí)間：2017-10-04 13:27

  本文關(guān)鍵詞：羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及其應(yīng)用

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【摘要】：目的:蛋白質(zhì)水解作為一種重要的翻譯后修飾,在細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生物化學(xué)過程中起著極其重要的作用。鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)可以進(jìn)一步加深我們對這些生化過程的認(rèn)識。近年來,鑒定蛋白質(zhì)水解的氨基端蛋白質(zhì)組學(xué)方法層出不窮,但羧基端組學(xué)方法卻很少。本課題中,我們首先將對蛋白質(zhì)羧基端生物酶標(biāo)記(Pro C-TEL)和親和純化效率兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化,將優(yōu)化后的Pro C-TEL和正向分離羧基端多肽方法應(yīng)用到E.coli全蛋白樣品中,以期對蛋白質(zhì)復(fù)雜樣品的羧基端多肽進(jìn)行正向分離富集并用質(zhì)譜鑒定。其次,將優(yōu)化后的Pro C-TEL和正向分離的方法應(yīng)用到藥物誘導(dǎo)凋亡的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞樣品中,鑒定凋亡過程中蛋白質(zhì)的水解。最后,探索數(shù)個(gè)羧肽酶Y突變體在Pro C-TEL中的應(yīng)用,探尋轉(zhuǎn)肽酶活性更好的羧肽酶Y突變體,從而對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行高效的羧基端標(biāo)記。方法:蛋白質(zhì)C端羧肽酶Y標(biāo)記方法是首個(gè)正向標(biāo)記分離蛋白質(zhì)C端多肽的方法。本課題中,通過優(yōu)化該方法中生物素標(biāo)記反應(yīng)的p H值以獲得標(biāo)記產(chǎn)物均一的實(shí)驗(yàn)條件;通過研究SDS含量對生物素標(biāo)記效率的影響,對羧肽酶Y標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化;通過對E.coli全蛋白復(fù)雜樣品羧基端親和標(biāo)記、親和純化和質(zhì)譜鑒定,對復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測;利用臺盼藍(lán)染色法、CCK-8檢測法和Western blotting檢測5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑(DRB)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的調(diào)控;聯(lián)合優(yōu)化后的Pro C-TEL技術(shù)、親和純化和質(zhì)譜鑒定對藥物誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡過程中的水解進(jìn)行質(zhì)譜鑒定;通過羧肽酶Y突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其在生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用,篩選可能提高生物素標(biāo)記效率的突變體羧肽酶Y,進(jìn)行羧肽酶Y介導(dǎo)的生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1)通過對比模型肽Ac-ASLTDYVKSYGA在不同p H條件下生物素標(biāo)記樣品的MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):在p H=11.5的反應(yīng)條件下,生物素標(biāo)記產(chǎn)物較為均一。2)通過增加生物素標(biāo)記體系中反應(yīng)緩沖液中SDS的含量和甲基酯化反應(yīng)后復(fù)溶緩沖液中SDS的含量,從Western blotting檢測和銀染結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)反應(yīng)體系中SDS含量為0.5%時(shí)為最佳生物素標(biāo)記條件。3)通過MALDI-TOF-MS以及LC-MS/MS結(jié)果發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后的Pro C-TEL技術(shù)聯(lián)合親和純化以及質(zhì)譜分析能夠正向分離檢測單一蛋白質(zhì)C端多肽。4)用優(yōu)化后的羧基端標(biāo)記方法來標(biāo)記E.coli復(fù)雜蛋白樣品羧基端,純化后共鑒定到了120多個(gè)蛋白質(zhì)羧基端多肽。5)用優(yōu)化后的Pro C-TEL技術(shù)檢測100?M DRB加藥處理6 h誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡過程中的水解,DMSO對照組共檢測到了81個(gè)生物素標(biāo)記多肽,DRB加藥組共鑒定出了88個(gè)生物素標(biāo)記多肽,并發(fā)現(xiàn)多個(gè)凋亡酶水解底物蛋白。6)在探索實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)盡管野生型以及突變體羧肽酶Y可以在原核表達(dá)體系中成功表達(dá),但其介導(dǎo)的生物素標(biāo)記效率并沒有明顯提高。結(jié)論:優(yōu)化后的Pro C-TEL技術(shù)可以更好地聯(lián)合親和純化及質(zhì)譜鑒定對蛋白質(zhì)的羧基端多肽進(jìn)行正向分離和鑒定。在E.coli復(fù)雜蛋白樣品中鑒定出了31個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)部水解位點(diǎn),有多個(gè)水解蛋白可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以及氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。由于產(chǎn)生的新的N端多肽太長或太短,這些蛋白質(zhì)水解后約有48%的水解位點(diǎn)不能被氨基端組學(xué)的方法鑒定出來。其次,優(yōu)化后的Pro C-TEL在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡過程中鑒定出了11個(gè)新的凋亡酶水解位點(diǎn)。綜上所述,本課題優(yōu)化的正向標(biāo)記分離蛋白質(zhì)C端多肽的方法是氨基端組學(xué)的一個(gè)有利補(bǔ)充,可以為鑒定許多生物化學(xué)過程(如細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等)中特定蛋白酶水解位點(diǎn)及底物的鑒定提供一個(gè)互補(bǔ)的組學(xué)方法。
【關(guān)鍵詞】：羧肽酶Y 羧基端標(biāo)記 ProC-TEL 蛋白質(zhì)水解 多發(fā)性骨髓瘤 細(xì)胞凋亡 CPY突變體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-16
• 1.1 羧肽酶Y概述11-12
• 1.2 蛋白質(zhì)水解及質(zhì)譜鑒定12-14
• 1.3 多發(fā)性骨髓瘤凋亡14-16
• 第二章 羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)C端和正向分離蛋白質(zhì)C端多肽16-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 2.1.3 主要試劑的配置17-20
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 2.2.1 甲基酯化21
• 2.2.2 多肽和蛋白的羧基端生物素標(biāo)記21-22
• 2.2.3 SDS含量對生物素標(biāo)記反應(yīng)效率的影響22
• 2.2.4 復(fù)溶緩沖液中SDS的含量對甲基酯化BL21全蛋白樣品復(fù)溶的影響22-23
• 2.2.5 SDS-PAGE、銀染和膠內(nèi)胰酶酶解23
• 2.2.6 質(zhì)譜樣品的準(zhǔn)備23-24
• 2.2.7 MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS檢測24
• 2.2.8 數(shù)據(jù)分析24-25
• 2.2.9 生物信息學(xué)分析25
• 2.3 結(jié)果與討論25-35
• 2.3.1 生物素標(biāo)記最佳p H的測定25-26
• 2.3.2 生物素標(biāo)記最佳SDS濃度的測定26-28
• 2.3.3 利用羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)C端和正向分離蛋白質(zhì)羧基端多肽28-30
• 2.3.4 利用優(yōu)化后的Pro C-TEL技術(shù)鑒定復(fù)雜蛋白樣品BL21全蛋白水解位點(diǎn)30-34
• 2.3.5 E. coli全蛋白樣品鑒定結(jié)果的生物信息學(xué)分析34-35
• 2.4 結(jié)論35-36
• 第三章 多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡過程中蛋白水解的鑒定36-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品36
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑36
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 3.2.1 多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)36-38
• 3.2.2 羧肽酶Y標(biāo)記多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞全蛋白復(fù)雜樣品38-39
• 3.2.3 膠內(nèi)酶解和親和純化生物素標(biāo)記多肽39
• 3.2.4 LC-MS/MS檢測39
• 3.2.5 數(shù)據(jù)分析39
• 3.3 結(jié)果與討論39-46
• 3.3.1 多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)39-42
• 3.3.2 OPM2凋亡誘導(dǎo)和生物素標(biāo)記效率驗(yàn)證42-44
• 3.3.3 多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡中蛋白水解的質(zhì)譜鑒定44-46
• 3.4 結(jié)論46-47
• 第四章 探索CPY突變體在羧肽酶標(biāo)記蛋白質(zhì)C端中的應(yīng)用47-64
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器47-50
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品47
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑47-48
• 4.1.3 主要試劑的配置48-50
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法50-58
• 4.2.1 野生型和突變體羧肽酶Y原核載體構(gòu)建和單克隆篩選50-51
• 4.2.2 野生型以及突變體羧肽酶Y的原核表達(dá)51-52
• 4.2.3 用原核表達(dá)的野生型和突變體羧肽酶Y標(biāo)記蛋白52-53
• 4.2.4 野生型和突變體羧肽酶Y的真核表達(dá)53-58
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論58-62
• 4.3.1 野生型和突變體CPY的原核表達(dá)及純化驗(yàn)證58-60
• 4.3.2 用原核表達(dá)的野生型及突變體羧肽酶Y對蛋白質(zhì)C端進(jìn)行生物素標(biāo)記60
• 4.3.3 野生型及突變體羧肽酶Y的真核表達(dá)60-61
• 4.3.4 野生型及突變體羧肽酶Y的真核表達(dá)61-62
• 4.4 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 綜述69-76
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 攻讀學(xué)位期間出版或公開發(fā)表的論著、論文76-77
• 中英語縮略詞對照表77-78
• 附錄78-94
• 致謝94-95

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 俞慶宏;戰(zhàn)榕;黃豪博;;三氧化二砷對骨髓瘤細(xì)胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2007年05期

2 劉善浩;張岱云;汪興洪;;Caspase-3蛋白在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及臨床意義[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2009年05期

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本文編號：970944