本文關(guān)鍵詞：GenoType MTBDRsl分子線性探針法診斷二線抗結(jié)核藥物和乙胺丁醇耐藥性的研究

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【摘要】：背景以及目的:耐藥結(jié)核病(DR TB)尤其是廣泛耐藥結(jié)核病(XDR TB)的出現(xiàn)嚴重阻遏了全球結(jié)核病的控制工作。廣泛耐藥結(jié)核病患者病情重、治療時間長、治療毒副作用大、死亡率高。因此,快速而準確的診斷廣泛耐藥結(jié)核病有利于及時制定化療方案和采取控制措施,減少疾病的進一步傳播以及提高患者的治療成功率。目前,由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢的特點,建立在固體培養(yǎng)基或者液體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)藥敏檢測方法耗時數(shù)周至數(shù)月才能提供藥敏結(jié)果,遠不能滿足臨床診斷和治療的需要。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,利用基因突變與耐藥的關(guān)聯(lián)性,對耐藥基因突變位點進行檢測,能快速得到藥敏結(jié)果,及時地診斷DR TB。商品化的試劑盒Geno Type MTBDRsl利用分子線性探針技術(shù),對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其耐氟喹諾酮類藥物、氨基糖苷類/環(huán)肽類藥物和乙胺丁醇耐藥基因進行分子生物學檢測。通過檢測最有意義的gyr A基因突變(編碼DNA促旋酶)確定對氟喹諾酮類藥物的耐藥性,檢測16S r RNA基因(rrs)確定對氨基糖苷類/環(huán)肽類藥物的耐藥性,檢測emb B基因(與emb A基因和emb C基因共同編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶)確定對乙胺丁醇的耐藥性。該技術(shù)可以一次同時檢測多種耐藥基因位點,可以直接檢測臨床涂片陽性標本,不需要昂貴的儀器設(shè)備,具有簡便、快速、實用、費用低廉的特點。本課題采用Geno Type MTBDRsl分子線性探針技術(shù)檢測左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素和乙胺丁醇耐藥基因突變,以期達到快速診斷廣泛耐藥結(jié)核病以及乙胺丁醇耐藥性的目的,及時為臨床治療提供可靠的化療依據(jù)。因此,應(yīng)用Geno Type MTBDRsl分子線性探針法快速檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌二線抗結(jié)核藥物和乙胺丁醇耐藥性具有重要的臨床意義。方法:2013年6月-2014年6月期間,北京胸科醫(yī)院189例患者通過Geno Type MTBDRplus分子線性探針法診斷為耐多藥結(jié)核病,其痰標本被進一步納入到基因型MTBDRsl分子線性探針法診斷廣泛耐藥結(jié)核病的研究中。我們采用以羅氏培養(yǎng)和快速培養(yǎng)為基礎(chǔ)的表型耐藥方法作為對照,統(tǒng)計Geno Type MTBDRsl分子線性探針法診斷的準確性,同時分析北京胸科醫(yī)院二線抗結(jié)核藥物和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因的突變情況,并采用基因測序的方法分析檢測結(jié)果不一致的痰標本。結(jié)果:1.基因型MTBDRsl分子線性探針法檢測結(jié)果的整體有效率為96.8%(183/189)。檢測左氧氟沙星耐藥性的靈敏度和特異度分別是81.6%和91.5%;檢測阿米卡星耐藥性的靈敏度和特異度分別是52.6%和99.2%;檢測卷曲霉素耐藥性的靈敏度和特異度分別是58.1%和97.7%;檢測乙胺丁醇耐藥性的靈敏度和特異度分別是69.8%和93.3%;檢測XDR TB的靈敏度和特異度分別是56.1%和100%。基因型MTBDRsl分子線性探針法和傳統(tǒng)的表型耐藥方法檢測LFX、AMK、CAP、EMB和XDR TB的一致性分別是85.4%、88.1%、90.0%,83.6%和88.3%,Kappa值分別是0.70,0.61,0.64,0.65和0.65.2.基因型MTBDRsl分子線性探針法得到檢測報告的平均時間為3天(范圍:1~6天),以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)藥敏方法得到檢測報告的平均時間為85天(范圍:65~105天),診斷周期縮短了96%。3.在98株LFX表型耐藥標本中,基因型MTBDRsl分子線性探針法確診了80株,突變率最高的是gyr A-ΔWT3,MUT 3C/D94G(36/80,45%),其次為gyr A-ΔWT3,MUT 3B/D94Y(11/80,13.75%)、gyr A-MUT1/A90V+3C/D94G(9/80,11.25%)、gyr A-MUT3B/D94N+3C/D94G(8/80,10.0%)、gyr A-MUT3C(5/80,6.25%)、gyr A-ΔWT2,MUT1(3/80,3.75%)、gyr A-ΔWT3,MUT3A(2/80,2.50%)、gyr A-ΔWT2,MUT2(1/80,1.25%)和gyr A-ΔWT2,MUT1+3A(1/80,1.25%),其余4(5%)株標本未顯示突變型條帶但伴有野生型條帶的消失;在基因型MTBDRsl分子線性探針法同時確診的20株AG/CP表型耐藥標本中,突變率最高的為rrs MUT 1/A1401G(15/20,75.0%),其次為rrs MUT 2/G1484T(3/20,15.0%)和rrs MUT 1/A1401G以及MUT2/G1484T(1/20,4.8%),其余1(4.8%)株標本未顯示突變型條帶但伴有野生型條帶的消失;在63株EMB表型耐藥標本中,基因型MTBDRsl分子線性探針法確診了44株,突變率最高的為emb B MUT 1B/M306V(26/44,59.09%),其次為emb B MUT 1A/M3061(6/44(13.64%),其余12(27.27%)株標本未顯示突變型條帶但伴有野生型條帶的消失。4.基因測序顯示了部分檢測結(jié)果不一致的標本的基因突變情況。在23株左氧氟沙星耐藥性檢測結(jié)果不一致的標本中,9株臨床分離株發(fā)生了gyr A基因突變,2株發(fā)生了gyr B基因突變。其中4株為表型敏感Genotype MTBDRsl耐藥,7株為表型耐藥Genotype MTBDRsl敏感;在25株乙胺丁醇耐藥性檢測結(jié)果不一致的標本中,8株臨床分離株發(fā)生了emb B基因突變。其中5株為表型敏感Genotype MTBDRsl耐藥,3株為為表型耐藥Genotype MTBDRsl敏感;在19株阿米卡星和16株卷曲霉素耐藥性檢測結(jié)果不一致的標本中,分別有3株和6株臨床分離株發(fā)生了rrs基因突變,但是未發(fā)現(xiàn)tly A基因突變。其中1株為阿米卡星表型敏感Genotype MTBDRsl耐藥,2株為阿米卡星表型耐藥Genotype MTBDRsl敏感;3株為卷曲霉素表型敏感Genotype MTBDRsl耐藥,3株為卷曲霉素表型耐藥Genotype MTBDRsl敏感。結(jié)論:本研究提供了耐藥結(jié)核病高發(fā)的醫(yī)院在聯(lián)合應(yīng)用基因型MTBDRsl和基因型MTBDRplus分子線性探針法診斷廣泛耐藥結(jié)核病的重要數(shù)據(jù)�；蛐蚆TBDRsl分子線性直接使用痰標本能快速篩查XDR TB。然而,基因型MTBDRsl分子線性探針法也存在明顯缺陷,如靈敏度低,極大地限制了其臨床應(yīng)用價值。為了提高基因型MTBDRsl分子線性探針法檢測XDR TB的靈敏度,應(yīng)該納入和分析更多與二線抗結(jié)核藥物耐藥性相關(guān)的基因突變。
【關(guān)鍵詞】：基因分子線性探針法 藥物敏感試驗 基因測序 二線藥物 基因突變
【學位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 第一章 前言17-21
• 第二章 材料和方法21-41
• 2.1 實驗材料21-23
• 2.1.1 標本來源21
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備21-22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.2 實驗原理及前準備23-26
• 2.2.1 實驗原理23
• 2.2.2 痰標本前處理23
• 2.2.3 直接痰涂片和萋-尼抗酸染色23-24
• 2.2.4 接種24-25
• 2.2.5 改良羅氏培養(yǎng)基25-26
• 2.2.6 液體MGIT960培養(yǎng)26
• 2.2.7 藥敏試驗臨界濃度(ug/ml)26
• 2.3 GenoType MTBDRsl LPA操作步驟26-33
• 2.3.1 DNA提取26-27
• 2.3.2 PCR擴增27-28
• 2.3.3 反向雜交28-29
• 2.3.4 結(jié)果判讀29-33
• 2.4 DNA測序33-39
• 2.4.1 測序引物合成33-34
• 2.4.2 測序菌株的篩選34
• 2.4.3 DNA提取34
• 2.4.4 PCR反應(yīng)體系的建立34-35
• 2.4.5 PCR產(chǎn)物凝膠電泳成像35-38
• 2.4.6 擴增產(chǎn)物的回收與純化38
• 2.4.7 耐藥DNA測序38-39
• 2.5 技術(shù)路線圖39
• 2.6 統(tǒng)計學方法39-41
• 第三章 結(jié)果41-49
• 3.1 一般情況41-43
• 3.2 GenotypeMTBDRsl分子線性探針法診斷準確性43-44
• 3.3 GenotypeMTBDRsl分子線性探針法診斷周期44
• 3.4 GenotypeMTBDRsl分子線性探針法診斷基因突變44-46
• 3.5 基因測序結(jié)果46-49
• 第四章 討論49-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 第六章 創(chuàng)新性55-56
• 第七章 局限性與進一步研究方向56-57
• 7.1 局限性56
• 7.2 進一步研究方向56-57
• 參考文獻57-65
• 綜述65-74
• 參考文獻72-74
• 發(fā)表論文情況74-75
• 致謝75-76
• 個人簡歷76-77

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 初乃惠;;應(yīng)重視耐藥結(jié)核病的規(guī)范化診治[J];中國臨床醫(yī)生;2013年03期

，

本文編號：969285