本文關(guān)鍵詞：酸敏納米載體聯(lián)合傳輸辛伐他汀和nogginsiRNA協(xié)同促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化基因調(diào)控的研究

  更多相關(guān)文章： 陽離子納米載體 pH敏感 聯(lián)合傳輸 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治療 骨缺損

【摘要】：研究背景骨缺損是臨床上常見的并發(fā)癥,也是臨床上較為棘手的問題,多由于創(chuàng)傷、感染及腫瘤切除后等因素所導(dǎo)致。骨不連引發(fā)的骨缺損多為原始創(chuàng)傷嚴(yán)重、急診處理不當(dāng)引起,若伴有骨感染時治療會更為困難。臨床上多伴有肌肉萎縮、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)僵硬等并發(fā)癥；其他并發(fā)癥如疼痛、肢體功能障礙等不僅給患者帶來了極大身體和心理上的負(fù)擔(dān),同時也給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于創(chuàng)傷后部分骨缺損的治療效果欠佳,過去截肢常成為此類疾病的最終治療方式。大量松質(zhì)骨移植對該病的治療是一個重大突破。骨搬運與骨牽引主要用于2-10cm骨缺損,但存在骨折對接部分延遲愈合,治療時間長等問題；游離骨皮瓣則用于5-12cm的缺損,常見的臨床并發(fā)癥為移植物不穩(wěn)和術(shù)后易再骨折。骨替代材料為另一個研究熱點,但仍不能達(dá)到治療創(chuàng)傷后部分骨缺損的目的。雖然傳統(tǒng)方法能在一定程度促進(jìn)骨折的愈合,且獲得一定程度的成功,但治療操作難度較大,治療周期較長,需反復(fù)多次手術(shù)等并發(fā)癥限制了其廣泛應(yīng)用。組織工程骨在解決移植骨的問題上是一個重大的突破。但就目前而言,尚無將組織工程骨成功轉(zhuǎn)化為自體骨的核心技術(shù)。所以必須尋找一種新的方法促進(jìn)骨生成。BMP-2因能有效地促進(jìn)骨折端的愈合而被廣泛應(yīng)用于臨床,但存在需要量大,供應(yīng)不足,本身制備困難,價格高昂等問題,嚴(yán)重限制了其臨床的廣泛應(yīng)用。辛伐他汀為臨床上主要的調(diào)血脂的藥物,研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)BMP-2,進(jìn)而促進(jìn)骨折的愈合。但小分子的游離辛伐他汀應(yīng)用存在水溶性低、易在肝臟代謝、穩(wěn)定性差、臨床應(yīng)用劑量大和局部注射細(xì)胞毒性大等問題,也限制了其應(yīng)用。RNAi技術(shù)自從其機(jī)制被發(fā)現(xiàn)以來,已被廣泛被沉默各種靶基因的的治療,具有廣闊應(yīng)用前景。本課題也運用RNAi技術(shù),通過下調(diào)noggin基因的表達(dá),去除其抑制BMP-2的作用,從另一個方面促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨。如何將小分子siRN A輸送到細(xì)胞也是現(xiàn)階段必須解決的問題,過去常運用病毒載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,結(jié)果表明病毒載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率雖高,但存在生物安全性問題。另外,siRNA分子在體內(nèi)應(yīng)用時存在體內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定,容易被巨噬細(xì)胞吞噬、被核酸酶降解等問題,且分子量較大、本身帶有負(fù)電荷也使得其難以穿過帶同樣負(fù)電的細(xì)胞膜,不能發(fā)揮沉默目的基因的作用,故必須尋找一種新的有效的方式來促進(jìn)其作用。本課題提出利用多功能納米藥物傳輸技術(shù),索出一種臨床適用、安全經(jīng)濟(jì)的聯(lián)合重建成骨的治療方案。首先,根據(jù)辛伐他汀先誘導(dǎo)VEGF促進(jìn)血管化再通過誘導(dǎo)BMPs促進(jìn)成骨的順序作用機(jī)理,應(yīng)用辛伐他汀促進(jìn)植入骨的成骨；其次,利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)BMPs的拮抗蛋白基因noggin的表達(dá),辛伐他汀與noggin siRNA(針對noggin的siRNA)聯(lián)用,從而在BMP s轉(zhuǎn)錄和蛋白相互作用兩個水平同時促進(jìn)骨生成。但siRNA和辛伐他汀直接用于治療存在給藥效率低和易降解的問題,也很難被共同傳輸?shù)焦切纬蓞^(qū)。因此,利用多功能納米載體將noggin siRNA和辛伐他汀同時靶向傳輸?shù)匠晒菂^(qū),促進(jìn)成骨的發(fā)生,發(fā)揮其1+12的協(xié)同增效作用,同時也提高辛伐他汀的給藥效率,達(dá)到減少辛伐他汀劑量和避免可能的副作用。因此,本課題設(shè)計合成了一種新型的三元嵌段聚合物聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸(N,N-二異丙基乙二胺-芐胺){nPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)}的酸性敏感納米載體,可用于聯(lián)合傳輸辛伐他汀和noggin siRNA。從而可同時發(fā)揮藥物及基因治療的雙重效果。辛伐他汀作用于成骨細(xì)胞后會促進(jìn)BMP-2的表達(dá),而noggin作為BMP-2的特異性拮抗劑,會抑制BMP-2的促進(jìn)成骨的作用。利用noggin siRNA可下調(diào)BMP-2誘導(dǎo)的noggin升高水平,將藥物治療和RNA干擾療法有機(jī)地結(jié)合起來,利用二者協(xié)同作用以達(dá)到促進(jìn)成骨治療骨不連的目的。本文主要通過體外實驗來驗證酸敏響應(yīng)性雙載體對MC3T3.E1細(xì)胞的作用,探討其在治療骨缺損方面的應(yīng)用潛力。研究目的本文的研究目的為設(shè)計一種酸敏納米載體,對其結(jié)構(gòu)和形狀進(jìn)行表征,進(jìn)一步研究其負(fù)載辛伐他汀和noggin siRNA的能力,空白納米載體對MC3T3-E1細(xì)胞的毒性作用,負(fù)載辛伐他汀的納米載體對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用；同時研究其體外細(xì)胞內(nèi)吸收定位情況,進(jìn)入細(xì)胞后的釋放情況；最后在基因、蛋白和堿性磷酸酶染色等方面研究納米載體同時負(fù)載辛伐他汀和siRNA對MC3T3-E1細(xì)胞的作用情況。研究方法1、化學(xué)方法合成聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),1H NMR核磁譜對聚合物進(jìn)行測試表征；2、BI-200SM動態(tài)光散射系統(tǒng)(Brookhaven Instruments)對不同N/P比的納米載體復(fù)合物進(jìn)行粒徑與Zeta電位測量,所得的每組樣品數(shù)據(jù),取5次測量的平均值；3、通過電鏡和繪制時間-累積釋放量圖分別驗證pH值為5.0和7.4時,在只負(fù)載辛伐他汀或同時負(fù)載辛伐他汀和siRNA的納米復(fù)合物中,辛伐他汀從納米載體中釋放的體外實驗；4、瓊脂糖凝膠實驗驗證不同N/P比納米載體與noggin siRNA的復(fù)合情況,按照納米載體是否負(fù)載辛伐他汀將其分為兩組；5、Cell Counting Kit-8法(CCK8法)檢測不同濃度無負(fù)載辛伐他汀納米載體(B-mPB P)對MC3T3-E1細(xì)胞的毒性作用；CCK8法檢測游離不同濃度辛伐他汀和負(fù)載辛伐他汀納米載體(D-mPBP) 對 MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響；6、應(yīng)用激光共聚焦(CLSM)定性和流式細(xì)胞術(shù)定量分析檢測納米載體的細(xì)胞內(nèi)吸收情況；7、Real-time PCR實驗驗證D-mPBP中不同濃度辛伐他汀和當(dāng)濃度luM時,不同作用時間對noggin及BMP-2基因表達(dá)的影響：D-mPBP中辛伐他汀濃度為10uM時,不同濃度noggin siRNA 對 noggin及BMP-2基因表達(dá)的影響；8、Real-time PCR實驗驗證noggin siRNA濃度為120nnM時,D-mPBP中辛伐他汀濃度為1,10 uM時,noggin及BMP-2基因表達(dá)情況,同時用Western blotting實驗、堿性磷酸酶和茜素紅成骨染色進(jìn)一步驗證；結(jié)果1、成功合成了聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA),'H NMR核磁譜圖顯示聚合物被成功合成：2、通過動態(tài)光散射系統(tǒng)對不同N/P比的D-mPBP/siRN A納米載體復(fù)合物進(jìn)行粒徑和表面電位測定。當(dāng)N/P=10時,納米載體復(fù)合物具有相對較小粒徑(40nm)和較弱的表面正電荷(+8mV)。因此,當(dāng)納米載體復(fù)合物的N/P為10時,其具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；3、透射電鏡表征和辛伐他汀體外釋放實驗表明在pH 7.4時,粒徑較為均勻、分布在40 nm左右,此時藥物呈緩慢釋放狀態(tài)；當(dāng)pH 5.0時,膠束膨大聚集,表現(xiàn)出快速釋放行為；4、瓊脂糖凝膠阻滯實驗結(jié)果：當(dāng)N/P比為10時,siRNA被完全復(fù)合而無條帶跑出,陽離子納米載體無論是否負(fù)載辛伐他汀都不會影響其負(fù)載siRNA的能力；5、CCK8法驗證空白納米載體細(xì)胞毒性實驗：以N/P=10與siRNA進(jìn)行復(fù)合時,當(dāng)空白納米載體的濃度高達(dá)430 ug/mL時,MC3T3-E1細(xì)胞的存活率仍高達(dá)90.5%,此時納米載體復(fù)合了siRNA,中和了一部分正電,從而降低了其對細(xì)胞的毒性作用；6、不同濃度的游離辛伐他汀對細(xì)胞并無毒性或增殖作用；負(fù)載辛伐他汀的納米載體對細(xì)胞增值有一定作用,但當(dāng)濃度為10uM時卻抑制細(xì)胞的增殖；7、激光共聚焦實驗及流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果：證實納米載體復(fù)合物能被MC3T3-E1細(xì)胞高效內(nèi)吞,轉(zhuǎn)染率高達(dá)86.4%,進(jìn)入細(xì)胞溶酶體后藥物緩慢釋放,結(jié)果顯示納米載體復(fù)合物是緩慢進(jìn)入細(xì)胞的,10min時部分進(jìn)入細(xì)胞,30min時進(jìn)入更多,到60min時已大部分進(jìn)入并開始釋放分離,120min時基本完全釋放；8、熒光定量PCR結(jié)果：納米載體負(fù)載辛伐他汀的濃度為1 uM時的作用效果最好,且最佳作用時間為48h；當(dāng)noggin siRN A的濃度越高,對noggin的抑制作用越好,當(dāng)高達(dá)為120 nM時,對noggin的抑制作用最好；9、當(dāng)noggin siRNA濃度為120nM時,辛伐他汀的濃度為1uM時的作用效果最佳。結(jié)果得到了Western blotting實驗、堿性磷酸酶和茜素紅染色結(jié)果進(jìn)一步驗證。結(jié)論本文主要通過體外實驗來探討酸敏響應(yīng)性雙載體在治療骨缺損方面的應(yīng)用潛力。本課題成功合成了聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸(N,N二異丙基乙二胺-芐胺)(mPEG-g-bPEI-g-PAsp (DIP-BA))的酸性敏感納米載體,運用透射電鏡、粒徑電位儀等測試了聚合物納米載體的形貌和粒徑,實驗結(jié)果表明,我們成功制備了粒徑較小、分布均勻的具有酸敏內(nèi)核的納米載體,其粒徑約為40nm,可以避免其快速地被腎臟排除和被RES攝取。從另一方面也增加了藥物的水溶性、延長了藥物的血液循環(huán)時間以及改善治療效果。生物學(xué)實驗結(jié)果強(qiáng)有力地證明：應(yīng)用pH敏感性陽離子納米載體協(xié)同運輸辛伐他汀和noggin siRNA能夠協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞成骨發(fā)生。這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在辛伐他汀誘導(dǎo)BMP-2的表達(dá),從而引發(fā)的noggin的上調(diào)可被同時運輸?shù)膎ogginsiRNA有效地降低,從而降低了noggin抑制成骨的作用,二者協(xié)同更好地促進(jìn)了成骨的發(fā)生。結(jié)果進(jìn)一步表明酸敏納米雙載體為骨組織工程的發(fā)展和骨缺損的治療提供了一個新的思路,我們將進(jìn)一步通體內(nèi)實驗進(jìn)行驗證。
【關(guān)鍵詞】：陽離子納米載體 pH敏感 聯(lián)合傳輸 辛伐他汀 noggin siRNA 基因治療 骨缺損
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 前言16-29
• 1.1 骨缺損的治療16-18
• 1.2. BMPs在促成骨中的應(yīng)用18-19
• 1.3 辛伐他汀在促成骨中的應(yīng)用19-20
• 1.4 Noggin基因和RNA干擾技術(shù)研究進(jìn)展20-21
• 1.5 藥物傳輸納米載體的研究現(xiàn)狀21-22
• 1.6 課題的提出和創(chuàng)新點22-23
• 參考文獻(xiàn)23-29
• 第二章 pH敏感納米載體聯(lián)合傳輸noggin siRNA和辛伐他汀促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化基因調(diào)控的研究29-69
• 2.1 引言29-32
• 2.2 實驗材料與方法32-37
• 2.3 實驗方法37-47
• 2.4 結(jié)果47-62
• 2.5 討論62-64
• 2.6 小結(jié)64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 在職期間學(xué)術(shù)成果69-70
• 致謝70-72

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：955118