本文關(guān)鍵詞：κ-酪蛋白形成淀粉樣纖維的抑制劑篩選與作用機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 淀粉樣纖維 抑制 κ-酪蛋白 L-精氨酸 人參皂苷 相互作用 熒光光譜學(xué)

【摘要】：在生理?xiàng)l件下,κ-酪蛋白很容易發(fā)生錯(cuò)誤聚集形成淀粉樣纖維(fibril),該纖維在女性乳腺的沉積可能導(dǎo)致乳房淀粉樣變性病。對(duì)κ-酪蛋白聚集過(guò)程的理解及其成纖維抑制劑的研究是治療該類(lèi)疾病的關(guān)鍵方向之一。RCMκ-酪蛋白是κ-酪蛋白的二硫鍵斷裂后的產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)與功能κ-酪蛋白基本相同,是用來(lái)研究κ-酪蛋白的淀粉樣纖維沉淀很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本論文采用多種光譜學(xué)方法研究了L-精氨酸(ARG)與人參皂苷(GS)對(duì)RCMκ-酪蛋白成纖維的影響以及二者與RCMκ-酪蛋白的相互作用,并對(duì)抑制機(jī)理進(jìn)行深入地探討。(1)我們通過(guò)共振光散射法(RLS),熒光法,紫外吸收法和透射電子顯微鏡(TEM)研究了體外模擬生理?xiàng)l件下ARG對(duì)RCMκ-酪蛋白淀粉樣fibril形成的影響及二者之間的相互作用。結(jié)果表明ARG可以抑制RCMκ-酪蛋白fibril的生成。RLS熒光的增強(qiáng)證明,二者發(fā)生相互作用,并形成了新的復(fù)合物。另外,ARG對(duì)RCMκ-酪蛋白的熒光具有強(qiáng)烈的靜態(tài)淬滅作用。通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)(ΔH,ΔS和ΔG)的分析表明,結(jié)合過(guò)程由熵驅(qū)動(dòng),自發(fā)進(jìn)行,且氫鍵和范德華力在此過(guò)程中發(fā)揮了主要作用。通過(guò)FRET的測(cè)量,RCMκ-酪蛋白Trp97與ARG的距離為2.94 nm。同步熒光實(shí)驗(yàn)表明,ARG使RCMκ-酪蛋白Trp97所處微環(huán)境極性減小且更加難于暴露于溶劑,這可能是抑制RCMκ-酪蛋白從天然狀態(tài)向纖維態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素。(2)我們采用Th T熒光法,TEM以及內(nèi)源熒光法研究了人參皂苷Rb1,Rg1,Rc和Re對(duì)RCMκ-酪蛋白fibril形成的影響。研究結(jié)果表明Rg1和Rb1可明顯抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成,二者均可以抑制fibril快速生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率,同時(shí)降低fibril最終生成數(shù)量;相反,由TEM觀(guān)察得知Re促進(jìn)fibril的生成,而Rc影響較小。內(nèi)源熒光實(shí)驗(yàn)顯示RCMκ-酪蛋白單獨(dú)孵育24 h后最大發(fā)射波長(zhǎng)λmax由336 nm藍(lán)移至331nm,意味著Trp97殘基周?chē)沫h(huán)境發(fā)生了變化。而當(dāng)加入Rg1后,蛋白最大發(fā)射波長(zhǎng)保持不變,表明Rg1通過(guò)穩(wěn)定RCMκ-酪蛋白的自然狀態(tài)從而阻止其fibril的形成。另外,我們研究了人參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其對(duì)蛋白淀粉樣fibril生成的影響的關(guān)系。(3)我們利用熒光法和紫外法研究了人參皂苷Rg1,Rb1和Re與RCMκ-酪蛋白相互作用。RLS熒光X椙恐っ鱃S與RCMκ-酪蛋白生成了新的復(fù)合體,同時(shí)我們對(duì)相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)(ΔH,ΔS和ΔG)進(jìn)行了計(jì)算。我們采用穩(wěn)態(tài)紫外吸收實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證二者是否形成了基態(tài)復(fù)合物,得出與RLS實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)論。根據(jù)相關(guān)熒光數(shù)據(jù)我們得到了不同溫度下GS與RCMκ-酪蛋白作用時(shí)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。通過(guò)FRET理論,我們計(jì)算了蛋白97位色氨酸殘基與GS的距離。加入GS后蛋白熒光壽命延長(zhǎng),表明疏水作用在GS與RCMκ-酪蛋白的結(jié)合中有重要作用。色氨酸殘基的同步熒光數(shù)據(jù)顯示Rg1和Rb1使其周?chē)芤涵h(huán)境極性下降。根據(jù)所有觀(guān)察結(jié)果,我們認(rèn)為Rg1和Rb1與RCMκ-酪蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后改變了蛋白分子的空間構(gòu)象及其表面的物理性質(zhì),從而可以抑制fibril的形成。
【關(guān)鍵詞】：淀粉樣纖維 抑制 κ-酪蛋白 L-精氨酸 人參皂苷 相互作用 熒光光譜學(xué)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• ABBREVIATION8-13
• 第1章 緒論13-24
• 1.1 蛋白錯(cuò)誤聚集/成纖維所致淀粉樣變性病13-14
• 1.2 乳房淀粉樣變性病14-15
• 1.3 κ-酪蛋白聚集/成纖維研究進(jìn)展15-18
• 1.3.1 κ-酪蛋白形成淀粉樣纖維的關(guān)鍵部位15-16
• 1.3.2 寡聚體的解聚是 κ-酪蛋白形成淀粉樣纖維的關(guān)鍵步驟16-17
• 1.3.3 κ-酪蛋白聚集/成纖維的抑制劑研究現(xiàn)狀17-18
• 1.4 L-精氨酸18-19
• 1.5 人參皂苷19-20
• 1.6 檢測(cè)手段20-22
• 1.6.1 ThT熒光檢測(cè)20-21
• 1.6.2 同步熒光法21
• 1.6.3 共振散射技術(shù)21-22
• 1.6.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移22
• 1.6.5 其他方法22
• 1.7 研究目的及內(nèi)容22-24
• 1.7.1 研究目的22-23
• 1.7.2 主要研究?jī)?nèi)容23-24
• 第2章 RCMκ-酪蛋白的制備24-34
• 2.1 引言24
• 2.2 材料與儀器24-25
• 2.2.1 材料24-25
• 2.2.2 儀器25
• 2.3 DEAE陰離子交換法分離純化酪蛋白成分25-27
• 2.3.1 酪蛋白制備25-26
• 2.3.2 層析條件26
• 2.3.3 結(jié)果與分析26-27
• 2.4 酪蛋白成分的反相高效液相色譜檢測(cè)27-31
• 2.4.1 樣品處理27
• 2.4.2 色譜條件27-28
• 2.4.3 結(jié)果與分析28-31
• 2.5 RCMκ-酪蛋白的制備和SDS-PAGE鑒定31-34
• 2.5.1 RCMκ-酪蛋白的制備31
• 2.5.2 SDS-PAGE電泳31-33
• 2.5.3 結(jié)果與分析33-34
• 第3章 ARG對(duì)RCMκ-酪蛋白成淀粉樣纖維的影響及二者相互作用的光譜學(xué)研究34-44
• 3.1 引言34-35
• 3.2 結(jié)果與討論35-43
• 3.2.1 ARG抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成35-36
• 3.2.2 ARG與RCMκ-酪蛋白相互作用的光譜學(xué)研究36-43
• 3.3 結(jié)論43-44
• 第4章 GS對(duì)RCMκ-酪蛋白成淀粉樣纖維的影響44-51
• 4.1 引言44-45
• 4.2 結(jié)果45-49
• 4.2.1 Rg_1和Rb_1抑制RCMκ-酪蛋白fibril的形成45-47
• 4.2.2 Rb_1和Rg_1使RCMκ-酪蛋白天然狀態(tài)保持穩(wěn)定47-48
• 4.2.3 Re促進(jìn)RCMκ-酪蛋白fibril的形成而Rc對(duì)fibril形成無(wú)影響48-49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 結(jié)論50-51
• 第5章 GS與RCMκ-酪蛋白相互作用的光譜學(xué)研究51-65
• 5.1 引言51-52
• 5.2 結(jié)果與討論52-64
• 5.2.1 GS對(duì)RCMκ-酪蛋白fibril生成的影響52-53
• 5.2.2 RLS表征GS與RCMκ-酪蛋白的相互作用53-54
• 5.2.3 RCMκ-酪蛋白與GS發(fā)生相互作用并形成了基態(tài)復(fù)合物54-55
• 5.2.4 RCMκ-酪蛋白結(jié)合GS后的熒光壽命55-57
• 5.2.5 GS與RCMκ-酪蛋白的結(jié)合導(dǎo)致熒光顯著增強(qiáng)且伴隨著蛋白結(jié)構(gòu)的改變57-58
• 5.2.6 GS改變了RCMκ-酪蛋白Trp97所處微環(huán)境的極性58-59
• 5.2.7 GS通過(guò)疏水作用力與RCMκ-酪蛋白結(jié)合59-61
• 5.2.8 GS與RCMκ-酪蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)及位點(diǎn)數(shù)61-62
• 5.2.9 FRET計(jì)算GS與RCMκ-酪蛋白Trp 97的距離62-63
• 5.2.10 Rg_1和Rb_1降低了RCMκ-酪蛋白進(jìn)入溶液的能力并阻止了其由寡聚體解聚為單體63-64
• 5.3 結(jié)論64-65
• 第6章 RCMκ-酪蛋白成纖維的抑制與機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)部分65-67
• 6.1 材料與儀器65
• 6.1.1 材料65
• 6.1.2 儀器65
• 6.2 方法65-67
• 6.2.1 ThT熒光實(shí)驗(yàn)65
• 6.2.2 TEM實(shí)驗(yàn)65-66
• 6.2.3 熒光光譜實(shí)驗(yàn)66
• 6.2.4 共振散射熒光實(shí)驗(yàn)66
• 6.2.5 熒光壽命測(cè)量66
• 6.2.6 同步熒光實(shí)驗(yàn)66
• 6.2.7 共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)66-67
• 第7章 結(jié)論和建議67-69
• 參考文獻(xiàn)69-78
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果78-80
• 致謝80

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 陳凡波;κ-酪蛋白形成淀粉樣纖維的抑制劑篩選與作用機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2016年

2 張瑩;基于納米磁珠的牛乳中κ-酪蛋白快速檢測(cè)方法的建立[D];吉林大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：931403