本文關(guān)鍵詞：硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的研究

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【摘要】：背景1962年,Beer等從長春花中提取并分離得到了長春堿(vinblastine. VLB)和長春新堿(vincristine, VCR),經(jīng)過不斷探索研究,人們已從長春花中分離得到70多種生物堿,臨床常用的該類藥物有長春堿(VLB)、長春新堿(VCR)以及半合成的長春瑞濱(vinorebine,VRB)和長春地辛(vindesine,VDS)。通過研究發(fā)現(xiàn),長春新堿在該類藥物中抗腫瘤活性最強(qiáng),具有很強(qiáng)的微管蛋白結(jié)合能力,同時(shí)還能抑制RNA多聚酶活性并干擾蛋白質(zhì)合成,能夠很好抑制腫瘤細(xì)胞增殖。主要用于治療何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病,也用于胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、軟組織肉瘤、支氣管肺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤,此外長春新堿也用于治療血小板減少性紫癜。長春新堿有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用,缺乏選擇性,在臨床應(yīng)用中所導(dǎo)致的消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等藥物不良反應(yīng)(ADR)事件也較為常見,所以臨床常常采用聯(lián)合用藥的方式來降低長春新堿的使用劑量,這是限制其發(fā)揮效應(yīng)的重要因素。脂質(zhì)體(liposome)是以磷脂為主要材料,組成的囊泡狀結(jié)構(gòu),與細(xì)胞膜相似,具有磷脂雙分子層,通過該結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)脂溶性和水溶性藥物包載,借助這一載體能夠?qū)崿F(xiàn)藥物靶向遞送,降低潛在毒性,提升藥物穩(wěn)定性。長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體(Long circulation thermosensitive liposome,LTSL)在普通脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上常使用PEG進(jìn)行修飾(如常用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000,DSPE-PEG2000),增大空間位阻,降低了脂質(zhì)體與血漿蛋白的結(jié)合,避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的捕捉和吞噬,延長了脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,同時(shí)PEG的引入也能夠防止脂質(zhì)體自身的聚集,提高制劑的穩(wěn)定性。其中,溫度敏感性磷脂的應(yīng)用,使脂質(zhì)體能夠在特定的相變溫度(Tm)將藥物釋放到加熱部位。當(dāng)達(dá)到該溫度時(shí),脂質(zhì)體的磷脂膜由原來緊密的全反式構(gòu)象(膠晶態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷傻耐崤?gòu)象(液晶態(tài)),膜的流動性也隨之大大提高,藥物更容易被釋放出來。通過使用不同的磷脂并調(diào)整所占比例能夠制備得到不同相變溫度的熱敏脂質(zhì)體。研究表明,將少量溶血磷脂(MSPC)引入熱敏脂質(zhì)體能夠進(jìn)一步提高其對溫度的敏感性,加速在相變溫度下的狀態(tài)變化,提升釋藥速度。目的制備長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體,借助腫瘤EPR效應(yīng)提高藥物的靶向性,降低常見毒性反應(yīng),實(shí)現(xiàn)加熱后藥物的快速釋放,提高治療部位藥物濃度。與市售注射用硫酸長春新堿比較,研究其細(xì)胞毒性及體內(nèi)抗腫瘤活性,評價(jià)長春新堿熱敏脂質(zhì)體作為實(shí)體腫瘤治療的預(yù)期效果及可行性。內(nèi)容采用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體,加壓過膜控制粒徑,pH梯度法主動載藥,制備得到長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體(VCR-TSL,VTSL).以外觀、粒徑、含量、包封率、熱敏特性、穩(wěn)定性等為主要評價(jià)指標(biāo),篩選最優(yōu)的處方工藝。使用高效液相色譜法建立長春新堿的含量及有關(guān)物質(zhì)分析方法,采用超濾離心法測定脂質(zhì)體包封率。利用透射電子顯微鏡測量并觀察脂質(zhì)體形態(tài),采用激光粒度分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑。利用穩(wěn)定性分析儀追蹤長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體5個(gè)月以上的穩(wěn)定性,同時(shí)測定含量、包封率、粒徑等變化。通過MTT法測定體外細(xì)胞毒性,激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記(Cou-6)脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用。進(jìn)一步建立裸鼠異種移植腫瘤模型,結(jié)合體外腫瘤部位加熱,對長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的藥效學(xué)及毒性進(jìn)行初步評價(jià)。結(jié)果采用DPPC、DSPE-PEG2000、MSPC為磷脂膜材料。通過對水化液,粒徑控制工藝,冷凍保護(hù)劑用量和投料方法等進(jìn)行系統(tǒng)篩選優(yōu)化,確定了以薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體,以0.2M、pH3.0的酒石酸緩沖液為水化液,加壓過膜法控制粒徑以及pH梯度法主動載藥的制備工藝。經(jīng)過處方優(yōu)化,制備得到的脂質(zhì)體平均粒徑在90nm左右：在透射電鏡下觀察,可見脂質(zhì)體的外觀圓整,粒徑大小分布均勻。該工藝制備得到的脂質(zhì)體藥物包封率能夠達(dá)到98%以上；多批樣品制備處方工藝重現(xiàn)性良好。長期試驗(yàn)表明,脂質(zhì)體在-20℃條件下放置5個(gè)月穩(wěn)定性良好。體外細(xì)胞毒性評價(jià)說明長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體結(jié)合加熱可顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒作用,在給藥后72h脂質(zhì)體組中,sw620細(xì)胞活性均小于5%,PANC細(xì)胞活性均小于20%。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱敏脂質(zhì)體加熱后更易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熱敏脂質(zhì)體結(jié)合腫瘤局部加熱,具有良好的腫瘤增值抑制效果,抑瘤率達(dá)到了70%以上,同時(shí),高劑量脂質(zhì)體組裸鼠體重和注射液組無顯著性差異,脂質(zhì)體組裸鼠進(jìn)食情況和活動能力較注射液組優(yōu),可以初步推斷能夠降低裸鼠全身毒性。結(jié)論本研究制備得到的硫酸長春新堿熱敏脂質(zhì)體具有良好的物理化學(xué)性質(zhì),工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性好,具有良好的熱敏釋藥特性。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,腫瘤細(xì)胞抑制作用顯著優(yōu)于普通注射液；體內(nèi)藥效學(xué)研究顯示其在實(shí)體瘤中的抑瘤活性明顯高于普通注射液,有望增加適應(yīng)癥范圍并開發(fā)成新的抗腫瘤藥物。
【關(guān)鍵詞】：長春新堿 長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體 藥效學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中英文縮寫對照表8-9
• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 引言14-26
• 1. 癌癥和惡性腫瘤發(fā)生趨勢14-15
• 2. 癌癥、惡性腫瘤的治療15
• 3. 腫瘤藥物市場情況15-17
• 4. 抗腫瘤藥物研發(fā)17-18
• 5. 長春新堿18-19
• 6. 脂質(zhì)體19-21
• 7. 長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體21-22
• 8. 脂質(zhì)體的常規(guī)制備方法22-23
• 9. 脂質(zhì)體藥物的研發(fā)情況23-24
• 10. 制備長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體24-26
• 第二章 硫酸長春新堿熱敏脂質(zhì)體的處方前研究26-42
• 1. 實(shí)驗(yàn)儀器與材料26-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果27-40
• 2.1 硫酸長春新堿含量測定的方法學(xué)建立與驗(yàn)證27-33
• 2.1.1 色譜條件27
• 2.1.2 破膜劑的選擇27
• 2.1.3 專屬性27-28
• 2.1.4 線性及范圍28-30
• 2.1.5 精密度30-32
• 2.1.6 樣品穩(wěn)定性32-33
• 2.2 硫酸長春新堿有關(guān)物質(zhì)測定方法及驗(yàn)證33-40
• 2.2.1 色譜條件33
• 2.2.2 溶液配制和要求33-34
• 2.2.3 系統(tǒng)適用性34-35
• 2.2.4 已知雜質(zhì)硫酸長春堿的線性及范圍35-37
• 2.2.5 破壞實(shí)驗(yàn)37-39
• 2.2.6 檢測限及定量限39-40
• 2.3 包封率的測定40
• 2.3.1 樣品制備方法40
• 2.3.2 分析條件及計(jì)算方法40
• 2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)40
• 3. 討論40-41
• 4. 小結(jié)41-42
• 第三章 硫酸長春新堿熱敏脂質(zhì)體的處方工藝研究42-56
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料42-43
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器42
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果43-54
• 2.1 空白脂質(zhì)體的基本制備工藝(圖3-1)43-44
• 2.1.1 磷脂成分的選擇43
• 2.1.2 磷脂膜的制備43
• 2.1.3 磷脂膜的水化43
• 2.1.4 空白脂質(zhì)體粒徑控制43-44
• 2.2 載藥基本工藝44-45
• 2.2.1 溶液配制44
• 2.2.2 脂質(zhì)體載藥方式44
• 2.2.3 空白脂質(zhì)體和載藥脂質(zhì)體的基本外觀44-45
• 2.3 脂質(zhì)體內(nèi)外水相緩沖鹽的篩選45-50
• 2.3.1 溶液配制45
• 2.3.2 載藥脂質(zhì)體的制備45-46
• 2.3.3 不同緩沖液制備得到脂質(zhì)體的比較46-50
• 2.4 載藥工藝的篩選50-51
• 2.4.1 不同工藝因素下載藥熱敏脂質(zhì)體制備及包封率測定50-51
• 2.4.2 不同載藥溫度的進(jìn)一步篩選51
• 2.5 VCR熱敏脂質(zhì)體制備工藝最終優(yōu)化51-54
• 2.5.1 鋪膜52
• 2.5.2 水化52
• 2.5.3 粒徑控制方法52
• 2.5.4 載藥52-53
• 2.5.5 工藝最終篩選結(jié)果53-54
• 3. 討論54-55
• 4. 小結(jié)55-56
• 第四章 硫酸長春新堿熱敏脂質(zhì)體物理化學(xué)性質(zhì)評價(jià)56-68
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料56
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器56
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料56
• 2 實(shí)驗(yàn)方法56-58
• 2.1 形態(tài)學(xué)檢查56-57
• 2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)觀察脂質(zhì)體基本形態(tài)56-57
• 2.1.2 動態(tài)光散射法(PCS)測定脂質(zhì)體粒徑57
• 2.2 穩(wěn)定性研究57-58
• 2.2.1 VCR脂質(zhì)體的包封率測定57-58
• 2.2.2 VCR脂質(zhì)體的含量測定58
• 2.2.3 VCR脂質(zhì)體有關(guān)物質(zhì)測定58
• 2.2.4 粒徑測定58
• 2.2.5 穩(wěn)定性儀器分析脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性58
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-66
• 3.1 形態(tài)學(xué)觀察58-59
• 3.2 粒徑分布測定結(jié)果59-60
• 3.3 長期穩(wěn)定性分析測定結(jié)果60-66
• 3.3.1 VCR脂質(zhì)體4℃保存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-61
• 3.3.2 VCR脂質(zhì)體-20℃保存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果61
• 3.3.3 VCR脂質(zhì)體穩(wěn)定性儀分析結(jié)果61-66
• 4. 討論66
• 5. 小結(jié)66-68
• 第五章 長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)68-75
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料68-69
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器68
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料68-69
• 1.3 細(xì)胞株69
• 2 實(shí)驗(yàn)方法69-71
• 2.1 溶液配制69
• 2.1.1 PBS緩沖液配制(pH 7.4)69
• 2.1.2 胰蛋白酶溶液配制69
• 2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基配制69
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)69-70
• 2.2.1 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇69
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代69-70
• 2.2.3 細(xì)胞的凍存70
• 2.3 硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)70-71
• 2.3.1 細(xì)胞接種70
• 2.3.2 藥物配制70
• 2.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)方法70-71
• 2.3.4 數(shù)據(jù)分析71
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-73
• 3.1 硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體sw620細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)71-72
• 3.2 硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體PANC細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)72-73
• 4 討論73-74
• 5 小結(jié)74-75
• 第六章 長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)75-78
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料75-76
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器75
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料75
• 1.3 細(xì)胞株75-76
• 2 實(shí)驗(yàn)方法76
• 2.1 溶液配制76
• 2.1.1 香豆素-6(Cou-6)標(biāo)記空白脂質(zhì)體制備76
• 2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料配制76
• 2.1.3 Hoechst33258溶液配制76
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)76
• 2.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)76
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-77
• 4 討論77
• 5 小結(jié)77-78
• 第七章 長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體體內(nèi)藥效學(xué)評價(jià)78-87
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料78-79
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器78
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料78
• 1.3 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動物78-79
• 2 實(shí)驗(yàn)方法79-81
• 2.1 荷瘤裸鼠模型建立79
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)79
• 2.1.2 荷瘤模型建立79
• 2.1.3 模型觀察79
• 2.2 供試藥品配制79-80
• 2.2.1 長春新堿注射液配制79-80
• 2.2.2 長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體配制80
• 2.3 腫瘤治療實(shí)驗(yàn)80
• 2.4 數(shù)據(jù)分析80-81
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果81-85
• 3.1 HepG-2荷瘤裸鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)81-83
• 3.2 MCF-7荷瘤裸鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)83-85
• 4 討論85-86
• 5 小結(jié)86-87
• 第八章 總結(jié)與展望87-89
• 參考文獻(xiàn)89-91
• 個(gè)人簡歷91-92
• 致謝92

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本文編號：905723