本文關(guān)鍵詞：NO供體型樺木醇衍生物的合成及抗腫瘤機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 樺木醇衍生物 合成 NO釋放 抗腫瘤 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的：樺木醇(Betulin, BT),一種重要的羽扇豆烷型三萜化合物,具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗炎等廣泛的藥理活性。但BT存在著水溶性低、藥效不顯著等問題,限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,為了獲得具有良好抗腫瘤活性的BT衍生物,本研究對系列樺木醇NO供體衍生物進(jìn)行了合成,并研究了各衍生物體外NO釋放,選擇人肝癌細(xì)胞株Huh7和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7評價(jià)化合物的增殖抑制作用,對潛在抗腫瘤作用衍生物的凋亡機(jī)制進(jìn)行探討。方法：采用酯化、親核取代、自由基取代等對BT的C-3、C-28或／和C-30進(jìn)行了修飾；Griess法測定了各衍生物體外NO釋放；MTT法及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評價(jià)了樺木醇NO供體衍生物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性；Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞技術(shù)檢測了樺木醇NO供體衍生物對細(xì)胞周期的影響及對線粒體膜電位的影響；免疫印跡技術(shù)檢測了對細(xì)胞周期蛋白(CDK1、CDC25C和CyclinB1)的表達(dá)影響,對凋亡相關(guān)蛋白(Caspase 3、Caspase 9和PARP)的剪切情況；對線粒體調(diào)控蛋白(Bcl-2、Bax)及細(xì)胞色素c(Cyt c)釋放的作用；對PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)改變的影響。結(jié)果：研究共合成7個(gè)NO供體的BT衍生物：3,28-二-[4-(2-硝氧基乙氧基)-1,4-丁二酰]-氧基樺木醇、3,28-二-[4-(4-硝氧基丁氧基)-1,4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇、3,28-二-乙酰氧基-30-硝氧基-樺木醇、3,28-二-{4-(8-硝氧-2,6-二氧二環(huán)[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基}-樺木醇、3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇、3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-樺木醇、3,28-二-(2-硝氧基-異丁酰氧基)-樺木醇。所有的化合物均經(jīng)紅外光譜、核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)等技術(shù)手段鑒定。各個(gè)BT衍生物的NO釋放情況各不相同,大多數(shù)衍生物的NO釋放量隨時(shí)間的變化改變不大,可較快達(dá)到平衡狀態(tài)。其中,3,28-二-(2-硝氧基-乙�；�)-氧基樺木醇具有良好的抗腫瘤活性,并成功抑制Huh7、MCF-7腫瘤細(xì)胞生長,呈劑量依賴性。Annexin V-FITC/PI雙染法證實(shí)3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡,通過調(diào)控Caspase家族蛋白通路來實(shí)現(xiàn)。其中Caspase 3與Caspase 9表達(dá)減少,而C-Caspase 3和C-Caspase 9表達(dá)明顯增加。此外,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇可使Huh7細(xì)胞阻滯于G2/M周期。JC-1檢測到線粒體跨膜電位的損失,且JC-1單體的綠色熒光表達(dá)從3.48%增加到23.4%,說明了化合物是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并影響線粒體調(diào)控蛋白的表達(dá)。研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降,而Bax表達(dá)水平增加,Cyt c從線粒體中大量釋放。Western Blotting結(jié)果顯示,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇呈劑量依賴性地顯著降低了P13K催化亞基p110α, AKT及p-AKT的水平。結(jié)論：3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇具有比樺木醇更強(qiáng)的抗肝癌活性,通過抑制PI3K/AKT通路,下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、降低線粒體膜電位以及促進(jìn)Cyt c的釋放,觸發(fā)Huh7細(xì)胞凋亡。因此,3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇作為一個(gè)具有潛在抗肝癌試劑,值得進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：樺木醇衍生物 合成 NO釋放 抗腫瘤 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R914.5;R96
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 引言9-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1 細(xì)胞凋亡10-11
• 1.1 PI3K/Akt通路10
• 1.2 線粒體通路10-11
• 2 樺木醇及其衍生物抗腫瘤作用的研究11-18
• 2.1 BT體外抗腫瘤作用11
• 2.2 BT體內(nèi)抗腫瘤作用11-12
• 2.3 增加BT水溶性12-13
• 2.4 提高BT生物活性13-18
• 3 NO供體藥物的研究18-19
• 4 研究目的與意義19-21
• 第二章 NO供體型樺木醇衍生物的合成21-35
• 1 儀器與試劑21
• 1.1 儀器21
• 1.2 主要試劑21
• 2 3,28-二-[4-(2-硝氧基-乙氧基)-1,4-丁二�；鵠-氧基樺木醇的合成21-23
• 2.1 合成路線22
• 2.2 3,28-二-(4-羧基-丁�；�)-氧基樺木醇(1)的合成22
• 2.3 3,28-二-[4-(2-溴基-乙氧基)-1,4-丁二酰基]-氧基樺木醇(2)的合成22-23
• 2.4 3,28-二-[4-(2-硝氧基-乙氧基)-1,4-丁二�；鵠-氧基樺木醇(3)的合成23
• 3 3,28-二-[4-(4-硝氧基-丁氧基)-1,4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇的設(shè)計(jì)合成23-25
• 3.1 合成路線24
• 3.2 3,28-二-(4-羧基-丁烯�；�)-氧基樺木醇(1)的合成24
• 3.3 3,28-二-[4-(4-溴-丁氧基)-1,4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇(2)的合成24-25
• 3.4 3,28-二-[4-(4-硝氧基-丁氧基)-1,4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇(3)的合成25
• 4 3,28-二-乙酰氧基-30-硝氧基-樺木醇的設(shè)計(jì)合成25-26
• 4.1 合成路線25-26
• 4.2 3,28-二乙酰氧基-樺木醇(1)的合成26
• 4.3 3,28-二乙酰氧基-30-溴-樺木醇(2)的合成26
• 4.4 3,28-二乙酰氧基-30-硝氧基-樺木醇(3)的合成26
• 5 3,28-二-{4-(8-硝氧-2,6-二氧二環(huán)[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基｝的設(shè)計(jì)合成26-28
• 5.1 合成路線27
• 5.2 3,28-二-(4-氯甲�；�-苯甲酰氧基)-樺木醇(1)的合成27
• 5.3 3,28-二-｛4-(8-硝氧-2,6-二氧二環(huán)[3.3.0]辛烷-4-氧)甲酰-苯甲酰氧基}(2)的合成27-28
• 6 3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇的設(shè)計(jì)合成28-29
• 6.1 合成路線28
• 6.2 3,28-二-(2-溴-乙酰氧基)-樺木醇(1)的合成28-29
• 6.3 3,28-二-(2-硝氧基-乙酰氧基)-樺木醇(2)的合成29
• 7 3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-樺木醇的設(shè)計(jì)合成29-30
• 7.1 合成路線29
• 7.2 3,28-二-(2-溴-丙酰氧基)-樺木醇(1)的合成29-30
• 7.3 3,28-二-(2-硝氧基-丙酰氧基)-樺木醇(2)的合成30
• 8 3,28-二-(2-硝氧基-異丁酰氧基)-樺木醇的設(shè)計(jì)合成30-31
• 8.1 3,28-二-(2-硝氧基-異丁酰氧基)-樺木醇的合成路線30
• 8.2 3,28-二-(2-溴-異丁酰氧基)-樺木醇(1)的合成30-31
• 8.3 3,28-二-(2-硝氧基-異丁酰氧基)-樺木醇(2)的合成31
• 9 討論31-35
• 9.1 合成條件探索31-32
• 9.2 結(jié)構(gòu)解析32-35
• 第三章 樺木醇衍生物的體外NO釋放測定35-39
• 1 Griess方法測定體外NO釋放原理35
• 2 儀器與試劑35
• 2.1 儀器35
• 2.2 試劑、規(guī)格及產(chǎn)地35
• 3 溶液的配制35-36
• 3.1 0.1mol/L的NaOH的配制35
• 3.2 L-半胱甘酸磷酸緩沖液的配制35
• 3.3 Griess溶液的配制35-36
• 3.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制36
• 3.5 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制36
• 3.6 受試品(NO供體型樺木醇衍生物)溶液的配制36
• 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制36-37
• 5 樺木醇類衍生物體外NO釋放量的測定37
• 6 討論37-39
• 第四章 NO供體型樺木醇衍生物在肝癌細(xì)胞Huh7和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外抗腫瘤活性篩選39-45
• 1 實(shí)驗(yàn)原理39
• 2 儀器、試劑及細(xì)胞株39-40
• 2.1 儀器39
• 2.2 試劑與細(xì)胞株39-40
• 3 溶液的配制40
• 4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理40-41
• 5 MTT實(shí)驗(yàn)41
• 6 各NO供體型樺木醇衍生物抗腫瘤活性比較41-43
• 7 討論43-45
• 第五章 3,28-二-[(2-硝氧基)-乙酰氧基]-樺醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh7凋亡活性的研究45-55
• 1 儀器、試劑與細(xì)胞株45-46
• 1.1 儀器45
• 1.2 試劑與細(xì)胞株45-46
• 2 溶液的配制46-47
• 3 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 3.1 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)47
• 3.2 DNA含量分析47
• 3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率47
• 3.4 線粒體膜電位檢測47
• 3.5 免疫印跡分析(Western Blotting)47-48
• 3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理48
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-53
• 4.1 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)48-49
• 4.2 DNA含量分析49
• 4.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率49-50
• 4.4 線粒體膜電位檢測50-51
• 4.5 免疫印跡分析(Western Blotting)51-53
• 5 討論53-55
• 第六章 結(jié)語55-56
• 1 研究結(jié)果55
• 2 研究特色與創(chuàng)新55
• 3 展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 附錄62-76
• 在校期間發(fā)表論文、項(xiàng)目資助及獎(jiǎng)勵(lì)情況76-77
• 致謝77-78
• 附件1:統(tǒng)計(jì)學(xué)處理合格證明統(tǒng)計(jì)學(xué)審核證明78

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本文編號(hào)：843447