本文關(guān)鍵詞：雙吲哚馬來酰亞胺類化合物BMA-155抗腫瘤活性及其機制的研究

  更多相關(guān)文章： BMA-155 HepG-2細胞 NF-κB/p65 p53 自噬 凋亡

【摘要】：惡性腫瘤是當今危害人類健康甚至危及生命的主要疾病之一。隨著老齡化問題的日益嚴重,其發(fā)病率逐年上升。而且,由于社會發(fā)展水平的提高和人們生活質(zhì)量的提升,患者逐漸趨于年輕化。據(jù)報道,估計2020年時的惡性腫瘤的發(fā)病率會增加一倍。肝癌是世界上十分常見的惡性腫瘤,因其在中國的發(fā)病率極高,還被稱作是“中國特色的腫瘤”。癌癥具有易突變易轉(zhuǎn)移且易產(chǎn)生耐藥性等特點,使得根治癌癥非常困難。目前常見的腫瘤治療方法包括手術(shù)、放療和化療三種,且臨床用藥的毒副作用大,容易傷害機體的正常細胞、組織和器官。由此,許多研究學(xué)者開始尋找低毒高效的新型化療藥物,這也成為目前腫瘤治療方面的一個重要的研究方向。中國海洋大學(xué)朱偉明課題組在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性的新型吲哚咔巴唑生物堿的基礎(chǔ)上,開展了對雙吲哚馬來酰亞胺類生物堿結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系的研究工作,設(shè)計并合成了一系列雙吲哚馬來酰亞胺類化合物,它們是一類具有烷基和腈基鏈的取代的結(jié)構(gòu)。我們的前期研究已表明這些化合物能夠抑制多株腫瘤細胞的生長。在初步篩選的過程中,我們發(fā)現(xiàn)修飾合成的雙吲哚馬來酰亞胺化合物BMA.155在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡之外,還會誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬。自噬也是細胞程序性死亡的一種方式,區(qū)別于凋亡性程序性細胞死亡(Ⅰ型程序性細胞死亡),自噬又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。細胞自噬是生物界一種基本的、普遍存在的生命學(xué)現(xiàn)象和過程,細胞可以不斷攝取和自我消化細胞自身的細胞質(zhì)成分。細胞自噬是真核生物維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制,主要是保護真核生物在不同的環(huán)境條件下生存下來,包括營養(yǎng)缺乏、生長因子缺乏、毒性蛋白集聚物的產(chǎn)生、細胞器結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)錯誤或其他微生物的入侵等。經(jīng)過初步的鏡下觀察,我們以人肝癌細胞HepG-2細胞為研究對象,初步探討了雙吲哚馬來酰亞胺類化合物BMA-155的誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬和凋亡的形態(tài)學(xué)變化及信號通路的調(diào)控。本課題的研究為BMA-155作為臨床用藥的美好前景提供了一定的理論依據(jù)。我們以HepG-2細胞株為研究對象,闡明了BMA-155對人肝癌細胞HepG-2自噬及凋亡的特征及其分子調(diào)控機制。我們通過MTT法檢測了BMA-155對肝癌細胞HepG-2細胞株生長的抑制作用,實驗結(jié)果顯示出BMA-155對肝癌細胞HepG-2細胞的細胞毒性呈時間和劑量的依賴性。用光學(xué)顯微鏡、電子透射顯微鏡、流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),化合物BMA-155處理細胞6 h后,細胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象,化合物誘導(dǎo)細胞15 h時的自噬現(xiàn)象最顯著。繼續(xù)延長給藥時間至24 h時,細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。我們通過DAPI染色和Annexin V/PI雙染等手段檢測發(fā)現(xiàn),不同濃度的化合物BMA-155處理細胞后,細胞出現(xiàn)皺縮、染色質(zhì)聚集、形成凋亡小體等典型的凋亡特點。到這里,我們確定化合物BMA-155能夠誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡。為了進一步確定自噬和凋亡之間的關(guān)系,我們借助了自噬的小分子特異性抑制劑3-MA。MTT細胞毒性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制自噬后,BMA-155誘導(dǎo)的細胞凋亡率升高(由IC50=16.6μM降低至IC50=9.5μM),即自噬的發(fā)生可以在一定程度上抑制BMA-155誘導(dǎo)德細胞凋亡。我們推測,細胞自噬在BMA-155誘導(dǎo)HepG-2細胞死亡的過程中起著一定的保護作用。另外,我們知道自噬和凋亡都是由一系列的基因調(diào)控,通過轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾等調(diào)控各種生物反應(yīng)。我們通過RT-PCR技術(shù)檢測了BMA-155誘導(dǎo)后,細胞內(nèi)基因NF-κB /p65 mRNA,p53 mRNA和自噬相關(guān)基Beclinl mRNA,凋亡相關(guān)基因Bax mRNA的水平均有所升高；另外,WesternBlot實驗結(jié)果顯示,BMA-155藥物處理細胞后,自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin-1的表達量升高,促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達量升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低。BMA-155也能夠促進NF-KB/p65及p53的活化,使得p-p53表達水平上升,IκB的表達量下降。BMA-155對蛋白表達的影響同樣呈現(xiàn)時間和劑量的依賴性。此外,我們發(fā)現(xiàn),用NF-κB/p65特異性抑制劑 BAY 11-7082抑制NF-κB/p65的活化可以降低BMA-155誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達。我們知道,由于化合物本身的特性(如水溶性、脂溶性等),許多化合物在體外的實驗效果顯著,但是再體內(nèi)的作用效果并不理想。為此,我們建立了裸鼠皮下移植瘤模型,通過裸鼠體重及腫瘤體積的測量、免疫組化、HE(蘇木-伊紅染色)、WesternBlot等檢測方法檢測了BMA-155給藥18天后的情況。結(jié)果表明BMA-155在體內(nèi)也能夠抑制腫瘤生長,且效果良好。綜上所述,BMA-155在體內(nèi)和體外均可以誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬和凋亡。在人肝癌細胞HepG-2細胞中,細胞自噬在細胞死亡的過程中發(fā)揮了保護性作用,而且BMA-155誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡有NF-κB/p65—p53信號通路的參與。本課題首次對雙吲哚馬來酰亞胺類的生物堿BMA-155進行抗肝癌活性及其分子調(diào)控機制的研究。實驗結(jié)果顯示：BMA-155是一個具有美好前景的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。我們的研究也為其今后的進一步研究與臨床開發(fā)提供了可觀的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：BMA-155 HepG-2細胞 NF-κB/p65 p53 自噬 凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 縮略語詞匯表16-18
• 第一章 緒論18-35
• 1.1 腫瘤及其常規(guī)治療方法18-19
• 1.2 細胞程序性死亡19-26
• 1.2.1 細胞凋亡20-22
• 1.2.2 細胞自噬22-24
• 1.2.3 細胞壞死24-25
• 1.2.4 細胞凋亡與細胞自噬的關(guān)系25
• 1.2.5 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別25-26
• 1.3 活性氧(reactive oxygen species,ROS)26-27
• 1.4 自噬的分子調(diào)控27-30
• 1.4.1 微管結(jié)合蛋白-1輕鏈-3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)28-29
• 1.4.2 Beclin129-30
• 1.5 凋亡的分子調(diào)控30-32
• 1.5.1 Bcl-2與Bax30-31
• 1.5.2 NF-κB與IκB31-32
• 1.6 p53與細胞凋亡32-33
• 1.7 BMA-155(Bisindolylmaleimide alkaloid-155)33-35
• 第二章 BMA-155誘導(dǎo)人肝癌細胞自噬及凋亡的形態(tài)學(xué)研究35-53
• 2.1 實驗材料35-37
• 2.1.1 細胞株35-36
• 2.1.2 化合物36
• 2.1.3 試劑36
• 2.1.4 主要試劑配制36-37
• 2.1.5 儀器37
• 2.2 試驗方法37-40
• 2.2.1 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)37-38
• 2.2.2 MTT法檢測BMA-155的細胞毒性38
• 2.2.3 細胞自噬的形態(tài)學(xué)觀察38-39
• 2.2.4 MDC染色39
• 2.2.5 DAPI染色39
• 2.2.6 FITC-Annexin V/PI雙染定量檢測細胞凋亡39-40
• 2.2.7 DCFH-DA染色檢測ROS水平40
• 2.2.8 數(shù)據(jù)分析40
• 2.3 實驗結(jié)果40-51
• 2.3.1 MTT檢測結(jié)果40-43
• 2.3.2 顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化43-45
• 2.3.3 MDC染色45-47
• 2.3.4 DAPI染色47-48
• 2.3.5 BMA-155誘導(dǎo)細胞凋亡,抑制自噬會增強細胞凋亡48-49
• 2.3.6 BMA-155誘導(dǎo)HepG-2細胞內(nèi)ROS水平升高49-51
• 2.4 討論51-53
• 第三章 BMA-155誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG-2自噬及凋亡的分子生物學(xué)研究53-72
• 3.1 實驗材料53-55
• 3.1.1 細胞株53
• 3.1.2 化合物53-54
• 3.1.3 試劑54
• 3.1.4 主要試劑配制54-55
• 3.1.5 儀器55
• 3.2 實驗方法55-61
• 3.2.1 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)55-56
• 3.2.2 免疫熒光染色56
• 3.2.3 RNA提取及實時定量PCR檢測56-57
• 3.2.4 Western blot蛋白印跡57-60
• 3.2.5 BMA-155在體內(nèi)對肝癌細胞的抑制作用60
• 3.2.6 HE染色60
• 3.2.7 免疫組化染色60-61
• 3.2.8 數(shù)據(jù)分析61
• 3.3 實驗結(jié)果61-69
• 3.3.1 BMA-155誘導(dǎo)的HepG-2細胞內(nèi)LC3累積61-62
• 3.3.2 BMA-155在體外促進NF-κB,p53,Beclin-1和Bax等基因的表達62-63
• 3.3.3 BMA-155體外調(diào)控自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達63-65
• 3.3.4 BMA-155體外增強NF-κB/p65、p53、p-p53等信號蛋白的表達65-66
• 3.3.5 BMA-155在體內(nèi)的細胞毒作用66-68
• 3.3.6 BMA-155能夠引起體內(nèi)腫瘤組織壞死68
• 3.3.7 BMA-155誘導(dǎo)體內(nèi)自噬及凋亡相關(guān)蛋白的變化68-69
• 3.4 討論69-72
• 創(chuàng)新與展望72-73
• 附錄73-78
• 參考文獻78-84
• 致謝84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文85-86
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表86

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