本文關(guān)鍵詞：負載siRNA的適配子修飾脂質(zhì)—聚合物復合納米粒的肺腫瘤靶向給藥系統(tǒng)研究

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【摘要】：目的:制備適配子修飾脂質(zhì)-聚合物復合納米粒的肺腫瘤靶向給藥系統(tǒng),研究對survivin siRNA的負載與傳遞能力,并對其安全性和有效性進行體內(nèi)外評價。方法:利用開環(huán)反應合成荷正電的類脂質(zhì)材料環(huán)氧烷胺衍生物(EAAD,Epoxy Alkyl Amine Derivative),并通過1H-NMR和FTIR進行表征。用納米沉淀法制備負載siRNA的適配子修飾脂質(zhì)-聚合物復合納米粒(AS1411-LHNPs),測定其粒徑、Zeta電位、siRNA的抗血清降解能力與體外釋放等。采用噴霧冷凍干燥法制備AS1411-LHNPs的干粉吸入劑,并進行制劑學評價。其次,利用MTT法、流式細胞儀(FCM)和激光共聚焦顯微鏡(CLSM)考察載體的細胞毒性及其對細胞攝取、胞內(nèi)分布、細胞周期與凋亡的影響。通過目標基因及蛋白表達水平,考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs對靶基因的沉默效果。以順鉑(DDP)為模型藥物,考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs對DDP的A549細胞抑制作用的影響。然后,利用Luciferase轉(zhuǎn)染的人源性肺腺癌細胞株(Luc-A549)建立裸鼠原位肺癌模型,小動物活體成像儀考察尾靜脈注射與肺部吸入給藥對Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs的裸鼠體內(nèi)分布影響。最后,通過小動物成像和CT考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs與DDP聯(lián)和應用對腫瘤的抑制效果,并利用HE染色研究裸鼠各器官組織的變化。結(jié)果:1H-NMR和FT-IR驗證了EAAD的結(jié)構(gòu),其純度約為93%。AS1411-LHNPs的粒徑為(73.0±3.8)nm,且外形圓整、粒徑均一,Zeta電位為(-5.9±0.6)mV,且能有效提高siRNA在血清中的穩(wěn)定性,并在pH 7.4的PBS介質(zhì)中緩慢釋放。噴霧冷凍干燥法制得LHNPs的干粉吸入劑,其空氣動力學粒徑為2.8μm左右,排空率大于90%,略有引濕性,能夠滿足肺部給藥系統(tǒng)的要求。MTT結(jié)果顯示,LHNPs安全性良好。細胞攝取與胞內(nèi)定位實驗結(jié)果表明,AS1411-LHNPs在A549細胞的攝取高達92%,且主要定位于細胞質(zhì)中。AS1411-LHNPs在A549-RAW264.7共培養(yǎng)體系中可避開RAW264.7的攝取,有選擇性的被A549細胞攝取。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,survivin siRNA-S1411-LHNPs顯著下調(diào)靶基因mRNA與蛋白的表達,且與Lipofectamine 2000相比具有長效作用。細胞周期和細胞凋亡實驗結(jié)果表明,與對照組相比,survivin siRNA-AS1411-LHNPs可顯著延長A549細胞的G2期并促進其凋亡。聯(lián)合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs和DDP,可顯著降低順鉑對A549細胞的IC50值,提高A549細胞對順鉑的敏感性,且存在一定的協(xié)同作用。Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs經(jīng)肺部吸入后,能提高肺部的局部藥物濃度,并延長藥物滯留時間。體內(nèi)抑瘤實驗和HE染色結(jié)果表明,聯(lián)合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs與DDP能明顯抑制肺腫瘤的生長,且能減少對DDP對正常組織的損傷。結(jié)論:本文成功構(gòu)建了負載survivin siRNA的AS1411修飾脂質(zhì)復合納米粒肺部給藥系統(tǒng),可有效遞送基因藥物,并下調(diào)相關(guān)基因及蛋白的表達。聯(lián)合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs和DDP,能顯著提高腫瘤細胞對DDP的敏感性,增強其抗腫瘤效果。
【關(guān)鍵詞】：survivin siRNA AS1411 脂質(zhì)復合納米粒 肺部給藥 原位肺癌模型
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-20
• 1 siRNA逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥12-13
• 1.1 siRNA12-13
• 1.2 survivin siRNA13
• 2 siRNA給藥系統(tǒng)的選擇13-15
• 2.1 給藥系統(tǒng)的選擇13-14
• 2.2 提高靶向性14-15
• 3 siRNA肺部給藥的優(yōu)勢15-16
• 4 展望16
• 5 本研究的意義和目的16-20
• 第二章 類脂質(zhì)材料的合成及表征20-25
• 1 實驗材料和儀器20
• 1.1 實驗材料20
• 1.2 實驗儀器20
• 2 實驗方法20-21
• 2.1 EAAD的合成20-21
• 2.2 DSPE-PEG2000-Mal的合成21
• 3 實驗結(jié)果21-24
• 3.1 EAAD的表征21-23
• 3.2 DSPE-PEG2000-Mal的表征23-24
• 4 本章小結(jié)24-25
• 第三章 AS1411-LHNPs的制備及評價25-39
• 1 實驗材料和儀器25-26
• 1.1 實驗材料25
• 1.2 實驗儀器25-26
• 2 實驗方法26-31
• 2.1 負載siRNA的脂質(zhì)復合納米粒（LHNPs）的制備26-27
• 2.2 包封率和載藥量的測定27
• 2.3 AS1411靶向脂質(zhì)復合納米粒（AS1411-LHNPs）的制備27-28
• 2.4 AS1411-LHNPs的表征28-29
• 2.5 體外釋放29
• 2.6 干粉吸入劑的制備29-30
• 2.7 干粉吸入劑理化性質(zhì)的評價30-31
• 3 實驗結(jié)果31-38
• 3.1 LHNPs制備處方的優(yōu)化31-32
• 3.2 包封率和載藥量的測定32-33
• 3.3 AS1411修飾的LHNPs的制備33-34
• 3.4 AS1411-LHNPs的制備及形態(tài)表征34-35
• 3.5 血清穩(wěn)定性考察35-36
• 3.6 體外釋放研究36-37
• 3.7 干粉吸入劑理化性質(zhì)的評價37-38
• 4 本章小結(jié)38-39
• 第四章 AS1411-LHNPs細胞學評價39-63
• 1 實驗材料和儀器39-40
• 1.1 實驗材料39
• 1.2 實驗儀器39-40
• 2 實驗方法40-46
• 2.1 LHNPs安全性的考察40
• 2.2 轉(zhuǎn)染時間對LHNPs的A549細胞攝取的影響40-41
• 2.3 FCM考察AS1411-LHNPs的A549細胞攝取41
• 2.4 CLSM考察AS1411-LHNPs在A549細胞中的分布41
• 2.5 AS1411-LHNPs在A549-RAW 264.7 共培養(yǎng)體系中的分布41-42
• 2.6 Western Blot法篩選高沉默效率survivin siRNA鏈42-43
• 2.7 RT-PCR考察survivin基因mRNA水平的表達43-44
• 2.8 A549細胞中survivin蛋白表達44
• 2.9 survivin siRNA對A549細胞凋亡的影響44
• 2.10 survivin siRNA對A549細胞周期的影響44-45
• 2.11 體外藥效學研究45-46
• 2.12 數(shù)據(jù)分析46
• 3 實驗結(jié)果46-61
• 3.1 LHNPs安全性的評價46
• 3.2 轉(zhuǎn)染時間對細胞攝取的影響46-48
• 3.3 AS1411-LHNPs在A549中的攝取48-49
• 3.4 AS1411-LHNPs在A549細胞中的分布49-50
• 3.5 AS1411-LHNPs在A549-RAW 264.7 共培養(yǎng)體系中的分布50-52
• 3.6 Western Blot法篩選高沉默效率survivin siRNA鏈52-53
• 3.7 RT-PCR考察survivin基因mRNA水平的表達53-54
• 3.8 A549細胞中survivin蛋白表達54-56
• 3.9 survivin siRNA-AS1411-LHNPs對A549細胞凋亡的影響56-58
• 3.10 survivin siRNA-AS1411-LHNPs對A549細胞周期的影響58-59
• 3.11 體外藥效59-61
• 4 本章小結(jié)61-63
• 第五章 AS1411-LHNPs體內(nèi)組織分布及藥效學評價63-74
• 1 實驗材料和儀器63
• 1.1 實驗材料63
• 1.2 實驗儀器63
• 2 實驗方法63-65
• 2.1 實驗動物63
• 2.2 溶液配制63-64
• 2.3 肺癌原位模型的建立64
• 2.4 體內(nèi)組織分布64
• 2.5 藥效學評價64-65
• 2.6 評價指標65
• 2.7 統(tǒng)計學分析65
• 3 實驗結(jié)果65-73
• 3.1 體內(nèi)組織分布65-68
• 3.2 藥效學評價68-73
• 4 本章小結(jié)73-74
• 全文總結(jié)74-75
• 參考文獻75-80
• 碩士學位期間科研成果80-81
• 致謝81-82

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6 劉瀚e，

本文編號：802454