本文關鍵詞：氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)合對抗耐藥白色念珠菌的作用及機制研究

  更多相關文章： 白色念珠菌 耐藥 氟康唑 鈣通道阻滯劑 聯(lián)合用藥 機制研究

【摘要】：近年來,侵襲性真菌感染在一些免疫力低下者的人群(如腫瘤患者,器官移植、導管插管患者及艾滋病患者等)中的發(fā)生率越來越高。這些臨床分離的侵襲性真菌中,念珠菌占有較高的比例,其中白色念珠菌引起的感染是念珠菌感染的主要組成部分。唑類抗真菌藥物尤其是氟康唑,憑借其安全、有效、價廉和低毒的特性成為預防和治療白色念珠菌所引起感染的首選藥。然而,隨著氟康唑在臨床治療中的頻繁使用,真菌的耐藥現(xiàn)象也隨之而來,給臨床治療深部真菌感染帶來極大的挑戰(zhàn)。研究一個新的抗菌藥物需要巨大的經(jīng)濟投入,強大的研究隊伍,而且將會耗時多年,因此,聯(lián)合用藥成為克服真菌耐藥的有效策略之一。近年來研究表明,許多非抗真菌藥物自身雖無強大的抗真菌作用,但能明顯增加唑類藥物的敏感性,這對于克服真菌耐藥性無疑是一種有效的途徑,也為新藥開發(fā)提供了新的線索與思路。唑類抗真菌藥物在臨床上治療深部侵襲性真菌病的應用非常廣泛,如果能通過聯(lián)合用藥的途徑,從已用于臨床的非抗真菌藥物中篩選出能夠增加唑類抗真菌藥物敏感性的有效藥物,這對于增加唑類這一安全、價廉的抗真菌藥物的臨床作用效果,意義重大。鈣穩(wěn)態(tài)是白色念珠菌正常生長的基礎,鈣離子不僅參與胞內(nèi)基礎代謝,還能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等重要細胞器的生理功能,而且鈣離子還可作為一種多功能信號載體調(diào)節(jié)白色念珠菌細胞的多種活動,包括形態(tài)發(fā)生、環(huán)境壓力應答以及致病性等。鈣通道阻滯劑(Calcium channel blockers, CCBs)為臨床常用藥物,安全性好,近年來許多研究表明多種鈣通道阻滯劑單用或與唑類抗真菌藥物聯(lián)合應用均有明顯抗白色念珠菌作用,如硝苯地平和維拉帕米單用能夠抑制白念芽管形成,維拉帕米,硝苯地平和尼莫地平能增強酮康唑抗真菌作用,維拉帕米與氟康唑聯(lián)用在對抗白色念珠菌生物被膜方面也具有協(xié)同作用。由此可見,鈣通道阻滯劑在抗真菌領域有著廣泛的應用前景,若能進一步將其抗真菌機制研究透徹,必然會為發(fā)展新的抗真菌方法提供重要思路。此外,我們觀察到,目前國內(nèi)外圍繞鈣通道阻滯劑的抗真菌實驗研究雖然較多,但是對臨床常用的這幾種該通道阻滯藥如氨氯地平,硝苯地平,貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯(lián)合抗真菌的作用卻沒有研究。本實驗選取臨床常用的這四種鈣通道阻滯劑,觀察其與氟康唑的聯(lián)合抗白色念珠菌作用,發(fā)現(xiàn)該組合表現(xiàn)出強烈協(xié)同作用,因此又對兩類藥物的協(xié)同作用機制進行了深入的探討與研究。若能將鈣通道阻滯劑與氟康唑藥物的協(xié)同抗耐藥白色念珠菌機制研究透徹,不僅能擴大鈣通道阻滯劑的臨床應用范圍,還將對抗真菌耐藥的研究產(chǎn)生重大的理論依據(jù)與現(xiàn)實意義。1.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)合抗白念的作用研究參照CLSI M27-A3方案中的棋盤法,用對倍稀釋的方法配制系列濃度的鈣通道阻滯劑(氨氯地平,硝苯地平,貝尼地平和氟桂利嗪)和氟康唑。分別吸取50微升的氟康唑和鈣通道阻滯劑類藥物加入96孔板各個孔內(nèi),再往各含藥孔中分別加入提前配好的終濃度約為1×103 CFU/ml的白念,在35度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h,用XTT-甲萘醌避光負載2h,用酶標儀測OD值,以真菌生長達到80%抑制時為判讀終點,用分數(shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI)法和非參數(shù)反應面(AE)法分別評價藥物聯(lián)用結(jié)果。結(jié)果顯示氨氯地平,硝苯地平,貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯(lián)用對耐藥白念的FIC1分別為0.017,0.019,0.035和0.033,均遠遠小于0.5,正負AE值相加之和遠大于200%,證明這兩類藥物聯(lián)合對耐藥白念的顯著協(xié)同作用。但對敏感白念無協(xié)同作用。于不同的EP管中分別加入CA10菌懸液,并加入一定濃度的不同藥物及組合,以XTT法分別測定不同時間點藥物作用的效果。以時間為橫坐標,以所測OD值為縱坐標,繪制不同藥物組合對CA1O的時間殺菌曲線圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生長對照組相比,6h之后各含氟康唑的組開始出現(xiàn)生長延遲,其中氟康唑和氨氯地平聯(lián)用組處理的真菌生長延遲最明顯,再次驗證了氨氯地平,硝苯地平,貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑的聯(lián)合抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同作用。2.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對真菌細胞內(nèi)鈣濃度的影響選取體外作用研究中與氟康唑協(xié)同效果最好鈣通道阻滯劑氨氯地平為主要受試藥。于10ml無菌離心管中過夜培養(yǎng)一定濃度的CA10菌液,離心收集菌細胞,用不含鈣的D-Hanks緩沖液清洗三次,再用D-Hanks緩沖液重懸,濾過分散細胞(300目尼龍網(wǎng)),調(diào)節(jié)菌液濃度為1×107CFU/ml,將調(diào)節(jié)后的菌液與終濃度為6μM的Fluo-3/AM在37-C下120rpm振蕩,避光負載50min,加入氨氯地平和氟康唑的單藥或組合藥后上機用流式細胞儀測各組胞內(nèi)熒光強度,來反映細胞內(nèi)鈣濃度。結(jié)果表明,和生長對照組相比,氨氯地平或氟康唑單用組中CA10細胞內(nèi)鈣離子幾乎無變化,兩種藥物聯(lián)用組中CA10細胞內(nèi)鈣離子濃度則有升高趨勢。由此可以推測,兩藥聯(lián)用對抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同機制可能與真菌細胞內(nèi)鈣離子紊亂有關。3.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對白色念珠菌細胞內(nèi)鈣通道相關基因表達的影響為進一步探討和研究兩藥聯(lián)用導致CA10細胞內(nèi)鈣濃度升高的原因,本實驗仍是以鈣通道阻滯劑中的氨氯地平與氟康唑作為受試藥,用熱酚法提取兩藥單用或聯(lián)用處理后CA10的總RNA,并設置不加藥的對照組。分別采用普通反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)和實時定量PCR(Real Time-PCR,RT-PCR)的方法對鈣信號通路中編碼細胞膜上鈣通道的基因(CCH1,MID1),編碼鈣調(diào)磷酸酶的基因(CNA1,CNB1)和編碼液泡膜上介導細胞內(nèi)高濃度鈣進入液泡內(nèi)的鈣通道基因(YVCl)的表達量進行測定。結(jié)果表明,與對照組和單用組相比,兩藥聯(lián)用組對CCHl和MID1的表達量無明顯影響,卻驚喜的發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組和能引起CNA1,CNB1和YVC1基因表達量的降低,尤其是CNA1的基因表達量,降低量最為明顯。由此我們可以推測,氨氯地平和氟康唑聯(lián)合的協(xié)同作用機制可能與抑制了(CNA1,CNB1,YVC1基因的表達有關。從而引起對鈣離子平衡調(diào)控起著重要作用的鈣調(diào)磷酸酶的功能和介導細胞內(nèi)高濃度鈣進入液泡的鈣通道受抑,導致CA10細胞內(nèi)鈣濃度的升高。4.鈣通道阻滯劑對氟康唑的耐藥基因及蛋白的表達和功能的影響由于藥物外排增加是白色念珠菌最常見的耐藥機制之一,本實驗分別利用PCR技術和羅丹明6G外排實驗從基因表達水平的變化和蛋白活性的變化兩個角度探究鈣通道阻滯劑氨氯地平等是否減弱了耐藥真菌對氟康唑的外排。通過熱酚法提取CA10的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用普通PCR和RT-PCR定性和定量測定的外排耐藥基因CDR1,CDR2和MDR1的表達變化。并利用羅丹明6G作為藥物外排的底物,探究鈣通道阻滯劑的加入是否抑制了真菌外排泵的活性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,氨氯地平和氟康唑單用或聯(lián)用對CDR1,CDR2和MDR1表達量的影響均無顯著差異。且羅丹明6G實驗表明鈣通道阻滯劑的加入并不能影響藥物的外排泵的活性。由此我們推測,鈣通道阻滯劑和氟康唑聯(lián)合協(xié)同作用機制與減弱藥物外排無關。綜上所有實驗證明,氨氯地平,硝苯地平,貝尼地平和氟桂利嗪和氟康唑聯(lián)合抗白色念珠菌具有強協(xié)同作用。協(xié)同作用機制可能與抑制了真菌細胞內(nèi)編碼鈣調(diào)磷酸酶的基因(CNA1, CNB1)和編碼液泡膜上介導高濃度鈣進入液泡的該通道基因(YVC1)的表達有關,從而引起鈣調(diào)磷酸酶的活性下降,介導細胞內(nèi)高濃度鈣進入液泡的鈣通道受抑,鈣平衡失調(diào),濃度升高。
【關鍵詞】：白色念珠菌 耐藥 氟康唑 鈣通道阻滯劑 聯(lián)合用藥 機制研究
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-18
• 符號說明18-20
• 前言20-26
• 第一章 氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)合抗真菌作用研究26-41
• 1 材料26-29
• 1.1 藥品與主要試劑26-27
• 1.2 藥品與主要試劑和培養(yǎng)基的配制27
• 1.3 主要儀器27-29
• 1.4 實驗菌株29
• 2 內(nèi)容與方法29-32
• 2.1 氟康唑與鈣通道阻滯劑聯(lián)合抗真菌靜態(tài)作用測定29-31
• 2.1.1 菌液制備29
• 2.1.2 微量稀釋法29-30
• 2.1.3 評價方法與結(jié)果判定30-31
• 2.2 氟康唑與鈣通道阻滯劑聯(lián)合抗真菌動態(tài)作用測定31-32
• 2.2.1 藥液和菌液制備31
• 2.2.2 時間-殺菌曲線的繪制31
• 2.2.3 評價方法與結(jié)果判定31-32
• 3 氟康唑與鈣通道阻滯劑的聯(lián)合抗真菌作用結(jié)果32-39
• 3.1 氟康唑與鈣通道阻滯劑的聯(lián)合抗真菌靜態(tài)作用結(jié)果32-38
• 3.1.1 氟康唑與鈣通道阻滯劑聯(lián)合的最低有效菌濃度32-35
• 3.1.2 FICI法評價FLC/AML、NIF、BEN和FNZ的協(xié)同作用35-37
• 3.1.3 △E法評價FLC/AML、NIF、BEN和FNZ的協(xié)同作用37-38
• 3.2 氟康唑與鈣通道阻滯劑的聯(lián)合抗真菌動態(tài)作用結(jié)果38-39
• 4 討論39-40
• 5 結(jié)論40-41
• 第二章 氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對真菌細胞內(nèi)鈣濃度的影響41-48
• 1 材料41-43
• 1.1 藥品與主要試劑41-42
• 1.2 藥品與主要試劑和培養(yǎng)基的配制42
• 1.3 儀器42-43
• 1.4 實驗菌株43
• 2 實驗內(nèi)容與方法43-44
• 2.1 菌液配置43-44
• 2.2 負載熒光染料44
• 2.3 實驗分組44
• 2.4 流式細胞術測定鈣離子濃度44
• 3 結(jié)果44-45
• 4 討論45-47
• 5 結(jié)論47-48
• 第三章 氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對白色念珠菌細胞內(nèi)鈣通道相關基因表達的影響48-59
• 1 材料48-50
• 1.1 藥品與主要試劑48-49
• 1.2 藥品與主要試劑和培養(yǎng)基的配制49
• 1.3 儀器49-50
• 1.4 實驗菌株50
• 2 試驗內(nèi)容與方法50-55
• 2.1 菌系統(tǒng)準備50-51
• 2.1.1 菌液稀釋50
• 2.1.2 菌液體系的配制與培養(yǎng)50-51
• 2.2 熱酚法提取總RNA51-52
• 2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA52
• 2.4 PCR擴增52-53
• 2.5 瓊脂糖凝膠電泳53
• 2.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)53-55
• 3 實驗結(jié)果55-57
• 3.1 普通PCR測定基因表達量的結(jié)果55-56
• 3.2 RT-PCR測定基因表達量的結(jié)果56-57
• 4 討論57-58
• 4.1 鈣通道相關基因的選取57
• 4.2 普通PCR和RT-PCR的比較57-58
• 5. 結(jié)論58-59
• 第四章 鈣通道阻滯劑對氟康唑的耐藥基因及蛋白的表達和功能的影響59-66
• 1 材料59-61
• 1.1 藥品與主要試劑59-60
• 1.2 藥品與主要試劑和培養(yǎng)基的配制60
• 1.3 儀器60-61
• 1.4 實驗菌株61
• 2. 試驗內(nèi)容與方法61-62
• 2.1 常見耐藥基因的表達量測定61
• 2.2 白色念珠菌外排泵活性測定61-62
• 2.2.1 菌液的制備61-62
• 2.2.2 藥物外排熒光測定62
• 3 實驗結(jié)果62-64
• 3.1 藥物對白念外排耐藥基因表達量的影響結(jié)果62-63
• 3.2 藥物對白色念珠菌外排泵蛋白活性的影響結(jié)果63-64
• 4 討論64-65
• 5 結(jié)論65-66
• 全文小結(jié)66-68
• 參考文獻68-76
• 致謝76-77
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及參編書籍77-78
• 附件78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 莊明明,溫奕欣,劉少列,洪曉鵬;流式細胞儀測定血小板胞漿游離鈣濃度[J];西安交通大學學報(醫(yī)學版);2005年05期

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本文編號：720831