本文關(guān)鍵詞：氨基酸代謝輪廓耦合RT-PCR分析誘變菌株高效發(fā)酵雷帕霉素

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【摘要】：雷帕霉素(Rapamycin)是一種天然的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,具有各種各樣的生物活性,例如抗真菌、免疫抑制劑、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和抗衰老等。在臨床上被用于器官移植的抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療,相比環(huán)孢菌素而言,雷帕霉素表現(xiàn)出更強(qiáng)的臨床藥用價(jià)值和更低的毒副作用,因此雷帕霉素的研究備受學(xué)術(shù)界和各大制藥企業(yè)的青睞與關(guān)注。1.根據(jù)以前文獻(xiàn)報(bào)道[1],莽草酸的添加能夠提高雷帕霉素的產(chǎn)量,本文從吸水鏈霉菌誘變菌株U2-3D9出發(fā),進(jìn)行新一輪紫外誘變篩選獲得一株雷帕霉素莽草酸耐受菌株U3-SD,其產(chǎn)量達(dá)到389.7 mg/L,相比誘變菌株U2-3D9(273 mg/L),雷帕霉素產(chǎn)量提高了42.7%。2.雖然通過紫外誘變獲得了一株雷帕霉素高產(chǎn)菌株,但是雷帕霉素高產(chǎn)機(jī)制仍然不清楚,而且通過比較吸水鏈霉菌誘變菌U3-SD與原始菌ATCC 29253胞外發(fā)酵特性,結(jié)果仍然無法揭示雷帕霉素的高產(chǎn)機(jī)制。為了剖析雷帕霉素生產(chǎn)機(jī)理并用于強(qiáng)化其合成,利用氨基酸代謝輪廓分析比較原始菌與誘變菌株U3-SD之間胞內(nèi)氨基酸庫變化來揭示限制雷帕霉素的合成因素。首先在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測(cè)下86種代謝物被鑒定,然后采用主成分分析、層聚類分析和偏最小二乘法分析發(fā)現(xiàn)原始菌和誘變菌之間存在代謝差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)與雷帕霉素合成相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物有22種,最后在此基礎(chǔ)上通過代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在雷帕霉素合成中具有重要的作用,包括賴氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鳥氨酸。3.在氨基酸代謝輪廓分析指導(dǎo)下,采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)上述7種氨基酸胞內(nèi)絕對(duì)含量,發(fā)現(xiàn)誘變菌細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝供應(yīng)不足,即“氮饑餓現(xiàn)象”,且與原始菌之間濃度差異最顯著的是賴氨酸。為了驗(yàn)證賴氨酸代謝是雷帕霉素合成的關(guān)鍵代謝模塊,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶活檢測(cè)分析賴氨酸代謝途徑上的關(guān)鍵酶(二氫吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和賴氨酸環(huán)化脫氨酶),結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘變菌賴氨酸代謝途徑上關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活均提高了,表明這三個(gè)酶與雷帕霉素合成具有正相關(guān)性,在理性指導(dǎo)下通過添加不同濃度的賴氨酸進(jìn)行雷帕霉素的高效發(fā)酵,結(jié)果當(dāng)添加5 g/L賴氨酸時(shí),誘變菌株U3-SD的雷帕霉素產(chǎn)量從389.7 mg/L上升至435.7 mg/L。
【關(guān)鍵詞】：代謝輪廓 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 二氫吡啶二羧酸合酶 雷帕霉素 吸水鏈霉菌
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R978.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-25
• 1.1 引言10-11
• 1.2 雷帕霉素及其衍生物11-15
• 1.2.1 雷帕霉素理化性質(zhì)11
• 1.2.2 雷帕霉素臨床作用機(jī)理和應(yīng)用11-12
• 1.2.3 雷帕霉素及其衍生物合成機(jī)理12-13
• 1.2.4 雷帕霉素菌種選育13-15
• 1.3 微生物代謝組學(xué)15-22
• 1.3.1 代謝組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)15-16
• 1.3.3 代謝組學(xué)分析方法16-21
• 1.3.4 代謝組學(xué)的應(yīng)用21-22
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用22-23
• 1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類與比較22-23
• 1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用23
• 1.5 本文研究的內(nèi)容和意義23-25
• 第二章 雷帕霉素紫外誘變高產(chǎn)菌的氨基酸代謝輪廓分析25-53
• 2.1 材料與儀器設(shè)備25-28
• 2.1.1 菌種25
• 2.1.2 藥品25-27
• 2.1.3 儀器設(shè)備27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-35
• 2.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法28-29
• 2.2.2 雷帕霉素檢測(cè)方法29-30
• 2.2.3 紫外誘變與篩選30-31
• 2.2.4 總糖的測(cè)定31-33
• 2.2.5 細(xì)胞干重的測(cè)定33
• 2.2.6 GC-MS樣品的提取及測(cè)定方法33-34
• 2.2.7 數(shù)據(jù)處理34-35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論35-51
• 2.3.1 高產(chǎn)菌株的誘變篩選與培養(yǎng)基優(yōu)化35-37
• 2.3.2 原始菌與誘變菌胞外發(fā)酵特性動(dòng)態(tài)變化37-38
• 2.3.3 與雷帕霉素合成相關(guān)的胞內(nèi)關(guān)鍵生物標(biāo)志物及代謝模塊確定38-48
• 2.3.4 氨基酸代謝模塊分析48-51
• 2.4 本章小結(jié)51-53
• 第三章 賴氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶分析與雷帕霉素高效發(fā)酵53-69
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料53-56
• 3.1.1 菌種、質(zhì)粒及引物53-54
• 3.1.2 主要試劑54-55
• 3.1.3 主要溶液55
• 3.1.4 主要儀器與設(shè)備55-56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-63
• 3.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法56
• 3.2.2 氨基酸的HPLC測(cè)定56-57
• 3.2.3 引物設(shè)計(jì)及基因測(cè)序57-58
• 3.2.4 目的基因片段的獲得58-60
• 3.2.5 吸水鏈霉菌mRNA的提取及檢測(cè)方法60-62
• 3.2.6 酶活檢測(cè)62-63
• 3.2.7 數(shù)據(jù)處理63
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論63-67
• 3.3.1 胞內(nèi)氨基酸絕對(duì)定量分析及比較63-64
• 3.3.2 賴氨酸代謝途徑上關(guān)鍵酶的實(shí)時(shí)熒光定量PCR轉(zhuǎn)錄分析64-65
• 3.3.3 賴氨酸代謝途徑上關(guān)鍵酶的酶活檢測(cè)分析65-66
• 3.3.4 賴氨酸與雷帕霉素合成之間關(guān)系及雷帕霉素高效發(fā)酵66-67
• 3.4 小結(jié)67-69
• 第四章 結(jié)論與展望69-71
• 4.1 結(jié)論69
• 4.2 創(chuàng)新點(diǎn)69-70
• 4.3 展望70-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明79-80
• 致謝80-81

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：703582