本文關(guān)鍵詞：可溶性鳥苷酸環(huán)化酶刺激劑（sGC003）對心肌肥大的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究意義及目的:心肌肥大是多種心血管疾病,如高血壓、心肌梗塞、缺血性心臟病、心瓣膜病等的共同病理過程,被認(rèn)為是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險因素。因此,改善心肌肥大對多種心血管疾病的治療有著重要意義。目前針對心肌肥大的治療藥物主要是基于抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng),盡管具有一定療效,但該類藥物大多只是減緩了心肌肥大發(fā)生發(fā)展的過程,而不能逆轉(zhuǎn)其發(fā)展進(jìn)程,故亟待尋找新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)。可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase,s GC)在一氧化氮(nitric oxide,NO)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。NO激活s GC,活化的s GC催化三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)反應(yīng)生成第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP),介導(dǎo)許多生理過程,如促進(jìn)血管和平滑肌舒張,抑制血小板凝聚、血管重構(gòu)、細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)生,參與神經(jīng)傳遞等。s GC在心血管系統(tǒng)表達(dá)豐富,已有許多研究證明在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中s GC表達(dá)量及活性有顯著變化,為其作為心血管疾病的治療靶點(diǎn)提供了一定的理論依據(jù)。由德國拜耳先靈制藥公司研發(fā)的s GC刺激劑riociguat已獲得美國、歐盟及日本在內(nèi)的多個國家批準(zhǔn),用于治療成人動脈型肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)和慢性血栓栓塞型肺動脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH),是第一個以s GC為靶點(diǎn)的肺動脈高壓治療藥物。s GC003是我所藥物合成研究室以riociguat為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并篩選得到的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的全新結(jié)構(gòu)化合物。本室前期藥效學(xué)評價研究表明,在慢性缺氧及野百合堿誘導(dǎo)的SD大鼠肺動脈高壓模型上,預(yù)防給予s GC003能顯著降低大鼠肺動脈壓,降低右心指數(shù),改善右心肥大,具有良好的藥理作用。但除了降低肺動脈壓的代償作用外,s GC003是否存在獨(dú)立的心臟活性作用而直接改善心肌肥大的可能性尚未驗(yàn)證。為此,本課題在離體水平觀察了s GC003對心臟的直接作用和對心肌細(xì)胞肥大的影響,并對其可能機(jī)制進(jìn)行了探討,期望為s GC003臨床適應(yīng)證的選擇提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.采用Langendorff離體心臟灌流模型,觀察s GC003對正常SD大鼠離體心臟冠脈流量、心率(HR)、左室內(nèi)壓(Pmax)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室壓最高值與心率乘積(RPP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等心功能指標(biāo)的影響。2.采用慢性缺氧2 wk誘導(dǎo)SD大鼠右心肥大。缺氧處理后利用Langendorff灌流模型,觀察s GC003對右心肥大SD大鼠離體心臟的冠脈流量、HR、Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等心功能指標(biāo)的影響。灌流結(jié)束后,分離右心室自由壁,左心室與室間隔,分別稱重,計算右心指數(shù)判斷右心肥大程度。3.采用混合酶消化法及差速貼壁法分離并純化SD乳鼠心肌細(xì)胞,用工具藥內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)10-8 mol/L刺激建立心肌細(xì)胞肥大模型,以riociguat為陽性對照,伴隨給予s GC003 10-8、10-7、10-6 mol/L,48 h后在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài),圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)對心肌細(xì)胞表面積進(jìn)行測量分析,BCA法檢測心肌細(xì)胞總蛋白含量,實(shí)時定量PCR法檢測心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)m RNA表達(dá)。4.采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測s GC003刺激SD乳鼠心肌細(xì)胞c GMP的生成量,明確s GC003對s GC活性的影響。5.采用免疫熒光法檢測s GC003對SD乳鼠心肌細(xì)胞活化的T細(xì)胞核因子(NFATc4)核轉(zhuǎn)位的影響,用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)分析NFATc4細(xì)胞核、質(zhì)熒光強(qiáng)度的比值。結(jié)果:1.s GC003對正常SD大鼠離體心臟的作用:s GC003 10-6、10-4 mol/L能顯著地增加正常SD大鼠離體心臟的冠脈流量、Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax(P0.05),具有良好的量效關(guān)系,對心率無顯著影響(P0.05)。2.s GC003對右心肥大SD大鼠離體心臟的作用:慢性缺氧使SD大鼠右心指數(shù)顯著增加(P0.001),造成了SD大鼠右心肥大。s GC003顯著增加右心肥大SD大鼠心臟的冠脈流量,對Pmax、LVDP、RPP、+dp/dtmax、-dp/dtmax表現(xiàn)出升高的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),對心率無影響(P0.05)。3.s GC003對ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響:與對照組相比,ET-1 10-8 mol/L刺激心肌細(xì)胞48 h,可使心肌細(xì)胞表面積增加80%(P0.001),總蛋白含量增加120%(P0.01),ANP m RNA水平升高140%(P0.01)。伴隨給予s GC003 10-8、10-7、10-6 mol/L能濃度依賴地對抗ET-1引起的心肌細(xì)胞表面積增大(P0.01)和總蛋白質(zhì)含量升高(P0.05),對于ET-1誘導(dǎo)的ANP m RNA再表達(dá)也有一定抑制作用(P0.05),其作用與對照藥物riociguat相當(dāng)。4.s GC003 10-7 mol/L使心肌細(xì)胞c GMP含量顯著升高4倍以上,由3.61 pmol/m L增加至14.66 pmol/m L(P0.001),預(yù)先給予s GC抑制劑ODQ處理組相比s GC003單獨(dú)處理組c GMP含量顯著下降(P0.05)。5.ET-1 10-8 mol/L刺激NFAT轉(zhuǎn)位入核,細(xì)胞核熒光強(qiáng)度與細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度的比值顯著增加(P0.001),s GC003 10-7 mol/L減弱ET-1引起的核內(nèi)熒光增強(qiáng)(P0.001),給予ODQ和PKG抑制劑KT5823分別抑制了s GC003的作用,核質(zhì)熒光強(qiáng)度比值增加(P0.001)。結(jié)論:1.s GC003增加離體心臟冠脈流量,營養(yǎng)心肌;并提高其收縮、舒張功能。2.s GC003抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。3.s GC003的作用與s GC-c GMP-PKG-NFAT途徑相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：可溶性鳥苷酸環(huán)化酶 刺激劑 sGC003 心肌肥大 心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-18
• 第一部分 sGC003對離體心臟的作用18-32
• 一、實(shí)驗(yàn)材料18
• 二、實(shí)驗(yàn)方法18-20
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-30
• 1. sGC003對正常SD大鼠心臟的作用20-24
• 1.1 sGC003對正常SD大鼠心臟冠脈流量的影響20-21
• 1.2 sGC003對正常SD大鼠心率的影響21-22
• 1.3 sGC003對正常SD大鼠心臟收縮功能的影響22-24
• 1.4 sGC003對正常SD大鼠心臟舒張功能的影響24
• 2. sGC003對慢性缺氧誘導(dǎo)右心肥大SD大鼠心臟的作用24-30
• 2.1 慢性缺氧對SD大鼠右心指數(shù)的影響24
• 2.2 慢性缺氧對心功能指標(biāo)的影響24-26
• 2.3 sGC003對右心肥大SD大鼠心臟冠脈流量的影響26
• 2.4 sGC003對右心肥大SD大鼠心臟心率的影響26-27
• 2.5 sGC003對右心肥大SD大鼠心臟收縮功能的影響27-29
• 2.6 sGC003對右心肥大SD大鼠心臟舒張功能的影響29-30
• 四、討論30-32
• 第二部分 sGC003對內(nèi)皮素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用32-46
• 一、實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 二、實(shí)驗(yàn)方法33-37
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-44
• 1. 心肌細(xì)胞生長狀況及形態(tài)37-38
• 2. ET-1 刺激心肌細(xì)胞肥大模型的建立38-40
• 2.1 ET-1 對心肌細(xì)胞表面積的影響38-39
• 2.2 ET-1 對心肌細(xì)胞ANP mRNA的影響39-40
• 3. sGC003對ET-1 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用40-44
• 3.1 sGC003對肥大心肌細(xì)胞表面積的影響40
• 3.2 sGC003對肥大心肌細(xì)胞ANP mRNA表達(dá)量的影響40-41
• 3.3 sGC003對肥大心肌細(xì)胞總蛋白含量的影響41-44
• 四、討論44-46
• 第三部分 sGC003作用于內(nèi)皮素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究46-54
• 一、實(shí)驗(yàn)材料46
• 二、實(shí)驗(yàn)方法46-49
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-52
• 1. sGC003刺激cGMP生成49
• 2. sGC003對NFATc4核轉(zhuǎn)位的影響49-52
• 四、討論52-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 個人簡歷62-63
• 致謝63

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