發(fā)布時間：2017-08-15 00:20

  本文關(guān)鍵詞：外源性磷酸肌酸對動脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性的作用的研究

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【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是許多心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ),與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)。磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)是一種高能磷酸化合物,在體內(nèi)可為ATP循環(huán)提供磷酸基團,參與能量運輸,是機體內(nèi)最直接、最主要的供能物質(zhì)之一目前PCr在臨床上主要用于心臟手術(shù)時加入心臟停搏液中,以保護心肌缺血狀態(tài)下的心肌代謝異常。許多研究表明,PCr除了在心肌保護中具有顯著作用外,還因其具有的抗氧化作用和膜穩(wěn)定作用等可以輔助治療多種心血管疾病,如心力衰竭,心肌梗死,腦缺血等。在體外藥理實驗中表明PCr可以通過阻滯細胞周期從而抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖。發(fā)表于2012年美國一項專利給藥理研究釋放了一個有意思的信號,它指出磷酸肌酸可以在體外溶解斑塊,那么磷酸肌酸是否有預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的作用,其可能的作用機制又是什么。本研究首次通過體內(nèi)體外模擬AS疾病,發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸可以有效抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成,并且使粥樣斑塊趨于穩(wěn)定,為患有心腦血管疾病合并動脈粥樣硬化的患者用藥提供了新的選擇。目的1、觀察外源性PCr對動脈粥樣硬化斑塊的形成和穩(wěn)定性的作用。2、初步探討外源性PCr對動脈粥樣硬化疾病治療作用的機理,及其對內(nèi)皮細胞功能的作用。方法1、動物模型建立與分組7-8周雄性ApoE-/-小鼠,全程高脂飼料喂養(yǎng)(含0.25%膽固醇和15%脂肪)12周,于高脂四周后,頸動脈分離并套管,縫合后繼續(xù)喂養(yǎng)八周,建立動脈粥樣硬化早、晚期模型。高脂喂養(yǎng)八周之后,將小鼠隨機分為五組：①陰性對照組(0.9%NaCl,0.1 ml/10g/d);②低劑量磷酸肌酸組(150mg/kg/d);③中劑量磷酸肌酸組(300mg/kg/d);④高劑量磷酸肌酸組(600mg/kg/d)⑤陽性對照組(辛伐他汀50mg/kg/d)。其中生理鹽水與磷酸肌酸均為尾靜脈注射給藥,辛伐他汀混于食物中喂食。2、體重、血清指標檢測小鼠處死前稱量體重并取血,測定血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白四項指標。3、組織病理學(xué)檢測與免疫組化染色取小鼠主動脈進行大體油紅0染色,用Image-Pro Plus 6.0定量陽性染色面積百分比得到主動脈斑塊大��；主動脈根及頸動脈進行冰凍組織切片,進行HE染色,觀察斑塊大�。磺衅M行油紅O染色,MOMA-2抗體染色,α-SMA抗體染色,天狼猩紅染色,觀察主動脈根斑塊中脂質(zhì)、巨噬細胞、平滑肌細胞以及膠原的含量,肌酸斑塊的易損指數(shù)。主動脈根部切片進行DHE染色,觀察斑塊的活性氧含量。4、分子生物學(xué)檢測取小鼠主動脈,western blot法測定MMP-2、MMP-9蛋白表達水平；使用BD公司CBA試劑盒和流式細胞測定儀檢測IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1蛋白表達含量；qRT-PCR檢測IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1、TIMP-1、MMP-2和MMP-9的mRNA水平含量；明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶pro-MMP-2,MMP-2,pro-MMP-9和 MMP-9 的活性5、探究PCr對內(nèi)皮細胞的作用及機制CCK-8檢測方法確定給藥濃度為20mmM。以氧化性低密度脂蛋白(oxLDL,100μg/ml)為刺激物體外模擬動脈粥樣硬化模型,Western blot法測定給予藥物刺激之后正常組、正常加藥組、oxLDL處理組、oxLDL處理加藥組NOX2的蛋白表達；qRT-PCR法測定四組細胞炎性因子的mRNA水平；DCFH-DA與DHE染色分別標定內(nèi)皮細胞中過氧化氫與超氧陰離子,通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測活性氧的含量；檢測PCr對MAPK不同家族激酶的作用。結(jié)果1、與NS組相比PCr各劑量組可以顯著降低ApoE-/-小鼠的血清中甘油三酯水平；中劑量組和高劑量組可以降低低密度脂蛋白水平；中劑量組可以降低總膽固醇水平；各組小鼠血清中高密度脂蛋白水平無明顯差異。2、與NS組相比,PCr各劑量組均可以降低ApoE-/-小鼠主動脈總體斑塊面積,主動脈弓斑塊面積和主動脈根斑塊面積,降低斑塊中ROS的含量,提高斑塊的穩(wěn)定性。3、蛋白檢測中,與NS組相比,磷酸肌酸中劑量和高劑量降低了ApoE-/-小鼠MMP-9蛋白含量(P0.05)；各劑量對MMP-2蛋白的含量無顯著影響；中、高劑量可顯著降低IL-6和TNF-α蛋白水平(P0.05)；高劑量可降低MCP-1蛋白水平(P0.05)；各用藥組對IL-10蛋白水平作用不明顯。mRNA水平檢測中,與NS組相比,磷酸肌酸中、高劑量可顯著降低IL-6與TNFα的mRNA水平,升高IL-10和TIMP-1的mRNA水平；高劑量可顯著降低MCP-1的mRNA水平(P0.05)。明膠酶譜法檢測MMPs舌性可以看到,與NS組相比,磷酸肌酸各劑量組pro-MMP-2和MMP-2活性變化不明顯,但各劑量均可顯著降低pro-MMP-9和MMP-9的活性。4、PCr可以減少oxLDL刺激的內(nèi)皮細胞中ROS的產(chǎn)生,降低NOX2的表達,減少促炎因子的分泌,并且通過抑制JNK的磷酸化水平減低MAPK信號通路的活化從而減少氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),減輕內(nèi)皮細胞的損傷。結(jié)論靜脈注射磷酸肌酸鈉對ApoE-/-小鼠具有明顯的抗動脈粥樣硬化作用,可以減小斑塊面積,增加斑塊穩(wěn)定性,其機制可能與其調(diào)節(jié)血脂、抗炎抗氧化等作用有關(guān),為臨床上心腦血管疾病用藥提供新的選擇。
【關(guān)鍵詞】：動脈粥樣硬化 磷酸肌酸 炎癥反應(yīng) 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-16
• 前言16-18
• 實驗材料18-25
• 實驗方法25-41
• 結(jié)果41-45
• 討論45-53
• 結(jié)論53-54
• 附錄I表格（Tables)54-56
• 附錄 II Figures56-72
• 參考文獻72-80
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表80

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭曉明;外源性磷酸肌酸對低氧大鼠心臟的保護作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2009年

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本文編號：675436