本文關(guān)鍵詞：基于DNA分子識別探針及信號擴增策略的博來霉素檢測新方法研究

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【摘要】：博來霉素,是一種重要的抗癌藥物,療效顯著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療,如鱗狀細胞癌、生殖細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、子宮頸癌以及惡性淋巴瘤等。博來霉素的治療窗較窄,且由于個體差異,相同劑量的藥物在不同的患者體內(nèi)會表現(xiàn)出不同的血藥濃度。因此,博來霉素血藥濃度監(jiān)測對于制定合理有效的臨床給藥方案、提高其抗癌療效以及降低毒副作用具有重要意義。博來霉素具有選擇性裂解DNA鏈的性質(zhì),因此利用特定DNA鏈作為反應(yīng)底物識別博來霉素,可以建立基于DNA納米技術(shù)的生物傳感方法,用于博來霉素的靈敏、特異檢測。相比于其他檢測技術(shù),基于DNA納米技術(shù)的生物傳感方法具有靈敏、特異、操作簡單及可程序化設(shè)計的優(yōu)勢。本論文以DNA納米技術(shù)為基礎(chǔ),設(shè)計并構(gòu)建了新型的博來霉素DNA識別探針,結(jié)合酶介導(dǎo)的信號放大策略,建立了新型的生物傳感分析方法,并將其用于博來霉素靈敏、特異、免標及快速檢測。本論文第一章為緒論部分,對博來霉素的發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用、博來霉素裂解DNA鏈的機理及博來霉素檢測方法進行了概述。并對生物傳感技術(shù)中常用的DNA分子識別探針和酶介導(dǎo)的等溫信號擴增策略進行了介紹。本論文第二章,設(shè)計并構(gòu)建了一種新型的博來霉素識別探針——雙環(huán)發(fā)夾探針,并利用該探針建立一種熒光生物傳感器,實現(xiàn)了博來霉素的免標記、靈敏檢測。雙環(huán)發(fā)夾探針包含兩個功能區(qū)域：博來霉素識別位點5'-GTGC-3’和DNA觸發(fā)序列。首先,博來霉素能夠特異性識別該探針,并將其切割,釋放觸發(fā)序列。過量的探針則能夠通過DNA分子內(nèi)雜交將DNA觸發(fā)序列沉默,從而降低方法的背景。接著,觸發(fā)序列觸發(fā)循環(huán)的鏈取代擴增反應(yīng)(SDA),實現(xiàn)檢測信號的放大,檢測限達0.34 nM,線性范圍為2 nM-220 nM,且首次實現(xiàn)了博來霉素的免標記檢測。該方法能夠準確區(qū)分博來霉素及其它抗腫瘤藥物,具有良好的選擇性。此外,方法的人血清回收率均在為95%-99%之間,說明該方法的準確性良好。但臨床實驗表明,在靜脈注射給藥方式下,人體內(nèi)博來霉素血藥濃度變化范圍(24 h)為1.4nM-2.7μM,因此本方法的靈敏度仍不能滿足臨床血藥濃度監(jiān)測的需要。為了進一步提高博來霉素檢測方法的靈敏度,本論文第三章利用雙環(huán)發(fā)夾探針介導(dǎo)的級聯(lián)信號擴增策略,建立了多重放大熒光傳感體系,實現(xiàn)了博來霉素的高靈敏、免標記檢測。該方法中,博來霉素識別并切割雙環(huán)發(fā)夾探針,釋放DNA觸發(fā)序列。接著觸發(fā)序列介導(dǎo)鏈取代擴增反應(yīng)(SDA)和指數(shù)擴增反應(yīng)(EXPAR),實現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。本方法的檢測達35 pM,線性范圍為40 pM-10 nM,能夠滿足臨床24 h內(nèi)患者血藥濃度監(jiān)測對方法靈敏度的要求。該方法能夠準確區(qū)分博來霉素及其它抗腫瘤藥物,具有良好的選擇性。同時方法在人血清中的回收率為95%-97%,說明本方法具有良好的準確性,能夠用于實際樣品中博來霉素的定量檢測。
【關(guān)鍵詞】：博來霉素 DNA分子識別探針 信號擴增 熒光傳感器
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 符號說明14-15
• 第一章 緒論15-36
• 1.1 博來霉素的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用15-17
• 1.2 博來霉素的抗癌作用機理17-18
• 1.3 博來霉素檢測方法研究進展18-23
• 1.4 DNA分子識別探針23-31
• 1.4.1 具有催化活性的DNA酶24-26
• 1.4.2 適體DNA26-30
• 1.4.3 其他30-31
• 1.5 酶介導(dǎo)的等溫信號擴增策略31-35
• 1.5.1 鏈置換擴增反應(yīng)32-34
• 1.5.2 滾環(huán)擴增反應(yīng)34-35
• 1.6 本論文的研究目的和研究內(nèi)容35-36
• 1.6.1 研究目的35
• 1.6.2 研究內(nèi)容35-36
• 第二章 雙環(huán)發(fā)夾探針介導(dǎo)的鏈置換擴增策略用于免標記檢測博來霉素36-55
• 2.1 引言36-37
• 2.2 實驗部分37-39
• 2.2.1 試劑37-39
• 2.2.2 儀器與裝置39
• 2.3 實驗步驟39-42
• 2.3.1 高溫高壓滅菌39-40
• 2.3.2 DNA的分裝及儲存40
• 2.3.3 博來霉素的活化及雙環(huán)發(fā)夾探針的裂解反應(yīng)40
• 2.3.4 鏈置換擴增反應(yīng)40
• 2.3.5 熒光測量40-41
• 2.3.6 聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗41-42
• 2.4 結(jié)果和討論42-54
• 2.4.1 實驗原理42-43
• 2.4.2 博來霉素檢測體系的可行性分析43-44
• 2.4.3 博來霉素檢測體系反應(yīng)條件的優(yōu)化44-49
• 2.4.3.1 雙環(huán)發(fā)夾探針堿基序列設(shè)計的優(yōu)化45-46
• 2.4.3.2 雙環(huán)發(fā)夾探針濃度優(yōu)化46-47
• 2.4.3.3 信號探針濃度優(yōu)化47
• 2.4.3.4 酶濃度優(yōu)化47-48
• 2.4.3.5 NMM濃度優(yōu)化48-49
• 2.4.4 博來霉素檢測體系的分析效能49-54
• 2.4.4.1 檢測體系的靈敏度和線性范圍49-51
• 2.4.4.2 精密度51-52
• 2.4.4.3 特異性考察52
• 2.4.4.4 在復(fù)雜生物基質(zhì)中的檢測性能以及回收率考察52-54
• 2.5 小結(jié)54-55
• 第三章 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增策略用于高靈敏且免標記檢測博來霉素55-72
• 3.1 引言55-56
• 3.2 實驗部分56-58
• 3.2.1 材料與試劑56-58
• 3.2.2 儀器與裝置58
• 3.3 實驗步驟58-60
• 3.3.1 高溫高壓滅菌58
• 3.3.2 博來霉素切割雙環(huán)發(fā)夾探針58-59
• 3.3.3 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增反應(yīng)59
• 3.3.4 熒光測量59-60
• 3.4 結(jié)果和討論60-71
• 3.4.1 實驗原理60-61
• 3.4.2 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增體系可行性分析61-62
• 3.4.3 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增策略反應(yīng)條件的優(yōu)化62-67
• 3.4.3.1 模板鏈HP_1堿基序列優(yōu)化62-63
• 3.4.3.2 模板鏈HP_2堿基序列優(yōu)化63-64
• 3.4.3.3 模板鏈HP_2濃度的優(yōu)化64-65
• 3.4.3.4 模板鏈HP_3濃度的優(yōu)化65-66
• 3.4.3.5 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增策略反應(yīng)時間的優(yōu)化66-67
• 3.4.4 酶介導(dǎo)的級聯(lián)擴增體系的分析效能67-71
• 3.4.4.1 靈敏度和線性范圍考察67-68
• 3.4.4.2 精密度考察68-69
• 3.4.4.3 選擇性考察69-70
• 3.4.4.4 復(fù)雜生物體系回收率實驗70-71
• 3.5 小結(jié)71-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻73-90
• 致謝90-91
• 碩士期間發(fā)表論文91-92
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表92

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本文編號：666305