發(fā)布時間：2017-08-13 07:18

  本文關(guān)鍵詞：氟西汀對抑郁癥模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用及其與自噬的相關(guān)性

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【摘要】：抑郁癥是一類以情緒低落、興趣喪失、悲觀、缺乏主動性、自責(zé)自罪等為主要臨床表現(xiàn)的精神疾病,嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為,全世界每年因抑郁癥自殺的死亡人數(shù)接近100萬。在中國,目前已確診的抑郁癥患者約為3000萬人,發(fā)病率達(dá)到6%,世界衛(wèi)生組織預(yù)測,到2020年抑郁癥將成為繼高血壓之后第二大臨床慢性疾病。目前僅一半數(shù)量的患者對抗抑郁藥有較好反應(yīng),70%的患者病情無法得到完全緩解,傳統(tǒng)的抗抑郁藥的療效雖值得肯定,但普遍存在起效慢、藥效弱、作用時間短的弊端,并且對多數(shù)的重度抑郁癥患者治療無效。深化對傳統(tǒng)抗抑郁藥的作用及其機(jī)制的認(rèn)識,可以為抗抑郁藥物的研發(fā)提供新的思路。抑郁癥涉及多種病理機(jī)制,包括傳統(tǒng)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)功能缺陷假說,神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌降低假說,下丘腦-垂體-腎上腺軸亢進(jìn),氧化應(yīng)激等。無論在抑郁癥患者還是動物模型中,星形膠質(zhì)細(xì)胞的病理學(xué)一直都占據(jù)著重要地位。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)位于神經(jīng)元和毛細(xì)血管之間,其通過調(diào)節(jié)糖代謝決定神經(jīng)元的微環(huán)境,同時對神經(jīng)遞質(zhì)(特別是谷氨酸)的攝取,突觸的成熟和發(fā)展以及血腦屏障的形成均起到?jīng)Q定性作用,它可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(包括睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等)和多種神經(jīng)元支持物(包括促進(jìn)軸突生長的糖蛋白、細(xì)胞粘附分子、層粘連蛋白等),對神經(jīng)元起著分隔和營養(yǎng)支持的作用。抑郁癥患者尸檢結(jié)果顯示在大腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯降低,并伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的減少,同時在抑郁癥模型中發(fā)現(xiàn)海馬或前額皮層GFAP的表達(dá)或GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均顯著下調(diào),星形膠質(zhì)細(xì)胞大量萎縮,進(jìn)一步說明星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙可能是抑郁癥重要的病理機(jī)制。然而,抑郁癥病理進(jìn)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞大量死亡和萎縮的機(jī)制尚不明確。自噬(Autophagy)是細(xì)胞自我降解的過程,通過去除錯誤折疊或聚集的蛋白以及損傷的細(xì)胞器減少細(xì)胞的壞死和凋亡。然而,抑郁癥病理進(jìn)程中是否發(fā)生星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的異常目前尚不清楚,并且我們?nèi)匀蝗鄙僬{(diào)節(jié)抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能的有效藥物。氟西汀(Fluoxetine)是第一個被發(fā)現(xiàn)的選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI),臨床上常用于治療成人抑郁癥、神經(jīng)性暴食癥和強(qiáng)迫癥等神經(jīng)精神疾患。氟西汀可以上調(diào)諸多腦區(qū)如前額皮層、海馬和紋狀體突觸間隙的5-羥色胺濃度,改善患者情緒。此外,氟西汀具有抗炎,抗凋亡,抗腫瘤,神經(jīng)保護(hù)等作用,在癌癥,腦卒中等疾病中發(fā)揮重要作用。有研究報道氟西汀可以通過誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡對頑固性伯基特淋巴瘤發(fā)揮治療作用,而氟西汀能否調(diào)節(jié)抑郁癥中星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能尚不明確。本文通過建立慢性溫和應(yīng)激(Chronic mild stress, CMS)誘導(dǎo)的小鼠抑郁癥模型,研究氟西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能的調(diào)節(jié)及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞存活中的作用。研究發(fā)現(xiàn)氟西汀可以顯著改善CMS模型所致海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成；培養(yǎng)原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,離體研究發(fā)現(xiàn)氟西汀可以通過促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用；CMS模型小鼠海馬立體定位注射自噬抑制劑3-MA可取消氟西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用,表現(xiàn)為GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞突起數(shù)量減少。上述結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬異常與抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性,氟西汀通過促進(jìn)自噬減少抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。本文的研究揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬在氟西汀神經(jīng)保護(hù)和抗抑郁效應(yīng)中的作用,進(jìn)一步拓寬了對氟西汀治療抑郁癥分子機(jī)制的認(rèn)識,也為研發(fā)新型抗抑郁藥物提供了新的思路。目的：研究氟西汀對抑郁癥模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié),揭示其通過促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用,闡明氟西汀抗抑郁作用的新機(jī)制。方法：1.本實驗將雄性C57BL/6J小鼠(體重18-25g)隨機(jī)分為4組：對照組、氟西汀單獨(dú)給藥組、抑郁癥模型組和抑郁癥模型+氟西汀治療組,每組20只,每只單籠飼養(yǎng),其中抑郁癥模型組、抑郁癥模型+氟西汀治療組給予慢性溫和應(yīng)激(CMS),持續(xù)6周,此期間對照組、氟西汀單獨(dú)給藥組正常飼養(yǎng)；通過糖水偏愛實驗檢測模型成功后,氟西汀單給藥組和抑郁癥模型+氟西汀治療組小鼠腹腔注射氟西汀(1Omg/kg/d, i.p.),同時對照組和抑郁癥模型組小鼠每天注射等量的生理鹽水,連續(xù)給藥4周后,通過糖水偏愛實驗、強(qiáng)迫游泳和懸尾實驗評價氟西汀對抑郁癥的治療作用；2.電鏡觀察小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的損傷及自噬小體的形成；3.培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,Western blotting檢測自噬的經(jīng)典指標(biāo)LC3和p62的表達(dá),GFAP-LC3熒光雙標(biāo)方法觀察氟西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)；4.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染1nTag-Wasabi-LC3質(zhì)粒,熒光顯微鏡下觀察氟西汀對皮質(zhì)酮模型下星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用；5.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,并使用MitoTracker deep red標(biāo)記線粒體,同時分別使用MitoTracker Green 和 LysoTracker標(biāo)記線粒體和溶酶體,觀察氟西汀對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬的作用；6.分別應(yīng)用H2DCF-DA和MitoSOX熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS,觀察給予氟西汀和皮質(zhì)酮刺激后細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS的生成,同時應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測氟西汀和皮質(zhì)酮刺激后的細(xì)胞活力；7.CMS模型小鼠腹腔注射氟西汀和自噬抑制劑3-MA并在處死前一周側(cè)腦室注射3-MA(30μg),小鼠腦組織經(jīng)多聚甲醛后固定、20%和30%蔗糖溶液梯度脫水后使用OCT膠包埋,Leica冰凍切片機(jī)制作25μm厚的海馬腦區(qū)連續(xù)切片,免疫熒光統(tǒng)計海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和突起數(shù)量。結(jié)果：1.氟西汀改善CMS模型小鼠抑郁樣行為小鼠造模5周后,糖水偏愛率及強(qiáng)迫游泳和懸尾不動時間相較于生理鹽水組顯著下降,氟西汀腹腔注射4周后,相較于CMS模型組小鼠糖水偏愛率升高11%,強(qiáng)迫游泳和懸尾不動時間分別縮短38%和34%,表明氟西汀可顯著改善CMS模型小鼠的抑郁樣行為。2.氟西汀改善CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成生理鹽水組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體形態(tài)正常,無損傷情況；單獨(dú)應(yīng)用氟西汀組小鼠線粒體形態(tài)正常,并可觀察到多個自噬小體；CMS模型組鏡下可觀察到大量損傷的線粒體,且并未觀察到自噬小體的存在；氟西汀治療組鏡下線粒體形態(tài)正常,且可觀察到自噬小體對損傷線粒體的吞噬,表明氟西汀可顯著改善CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成。3.氟西汀促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬氟西汀0.1、1.0、10μM三個濃度分別處理24h后,10μM氟西汀顯著上調(diào)LC3 Ⅱ/Ⅰ匕值(P0.01),顯著下調(diào)自噬底物p62的表達(dá)(P0.01)；氟西汀(10μM)處理12、24h后均顯著上調(diào)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值,下調(diào)自噬底物p62的表達(dá)(P0.01),其中24h時作用最顯著(P0.01),相比于對照組LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調(diào)了76%,p62的表達(dá)下調(diào)72%,表明10μM氟西汀處理24h顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬。4.氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬小體和自噬溶酶體的形成使用GFAP和LC3抗體分別標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和自噬小體,10μM氟西汀處理24h后,胞內(nèi)LC3 Ⅱ表達(dá)量顯著多于對照組(P0.01)；給予10μM皮質(zhì)酮刺激后,LC3 II表達(dá)量顯著減少(P0.05),10μM氟西汀治療后顯著增加LC3 Ⅱ表達(dá)量(P0.01),相較于皮質(zhì)酮組,平均每個細(xì)胞中LC3 Ⅱ表達(dá)量增加了10倍。使用mTag-Wasabi-LC3紅綠熒光質(zhì)粒標(biāo)記胞內(nèi)L℃3蛋白,10μM氟西汀處理24h后,胞內(nèi)自噬小體(黃色斑點(diǎn))數(shù)量和自噬溶酶體(紅色斑點(diǎn))數(shù)量均顯著增加(P0.05);10μM皮質(zhì)酮刺激后胞內(nèi)自噬小體數(shù)量顯著下調(diào)(P0.01),10μM氟西汀治療后自噬小體顯著增加(P0.01),自噬溶酶體數(shù)量亦顯著上調(diào)(P0.05),相比于皮質(zhì)酮組,平均每個細(xì)胞中自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量分別增加了18倍和15倍。表明氟西汀可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬小體和自噬溶酶體的形成,保持自噬流的暢通。5.氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬 10μM皮質(zhì)酮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬,其中自噬小體和線粒體的共定位顯著減少(P0.05),線粒體和溶酶體共定位顯著減少(P0.01),胞漿Parkin表達(dá)顯著上調(diào)(P)0.05),線粒體Parkin表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),線粒體外膜蛋白TOMM20表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01)；10μM氟西汀治療促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬,其中自噬小體和線粒體共定位顯著增加(P0.05),線粒體和溶酶體共定位顯著增加(P0.01),相比于皮質(zhì)酮組分別增加了63%和49%,Parkin向線粒體的轉(zhuǎn)位顯著增加(P0.05),相較于皮質(zhì)酮組增加了37%,10μM氟西汀處理后增強(qiáng)了對線粒體外膜蛋白TOMM20的泛素化降解作用(P0.01),與皮質(zhì)酮組相比,TOMM20蛋白表達(dá)減少了36%。表明氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞Parkin的線粒體轉(zhuǎn)位,啟動線粒體自噬,增加對線粒體蛋白TOMM20的降解。6.氟西汀通過促進(jìn)自噬發(fā)揮對原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用 應(yīng)用H2DCF-DA熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS, MitoSOX標(biāo)記線粒體ROS,10μM皮質(zhì)酮刺激24h后顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS和線粒體ROS水平(P0.01),降低細(xì)胞活力(P0.01)；氟西汀處理24h后胞內(nèi)和線粒體ROS生成減少(P0.05),細(xì)胞活力增強(qiáng)(P0.05),與皮質(zhì)酮組相比,線粒體ROS水平下降了25%,細(xì)胞活力上升了56%；給予自噬抑制劑3-MA(5mM)后,ROS釋放增多(P0.05),細(xì)胞活力降低(P0.05),相較于氟西汀治療組,線粒體ROS水平上升了22%,細(xì)胞活力下降30%。表明氟西汀通過促進(jìn)自噬減少皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS的釋放,增強(qiáng)細(xì)胞活力,發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。7.氟西汀通過促進(jìn)自噬發(fā)揮對CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用 氟西汀逆轉(zhuǎn)CMS模型所致小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)減少以及行為學(xué)不動時間的增加,與CMS組小鼠相比,海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量增加了2倍,GFAP陽性細(xì)胞數(shù)增加了38%。注射自噬抑制劑3-MA后,氟西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用被取消,相比于氟西汀治療組,海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量顯著減少(P0.01),GFAP陽性細(xì)胞數(shù)減少(P0.05)。表明氟西汀通過促進(jìn)自噬增加CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量和SGZ區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù),減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷,發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)論：1.星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬異常與CMS所致小鼠抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性。2.氟西汀通過促進(jìn)線粒體自噬減少抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和萎縮,發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。本文工作的主要創(chuàng)新之處：1.揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬在抑郁癥病理過程中的重要角色,深化了對抑郁癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。2.闡明氟西汀通過調(diào)節(jié)線粒體自噬發(fā)揮對抑郁癥模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用,為抗抑郁藥物的研發(fā)提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：氟西汀 星形膠質(zhì)細(xì)胞 自噬 線粒體 抑郁癥
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-13
• 英文摘要13-19
• 前言19-26
• 材料與方法26-32
• 結(jié)果32-47
• 討論47-52
• 結(jié)論52
• 結(jié)語52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 附錄 綜述63-79
• 參考文巧73-79
• 在讀期間發(fā)表的的文章79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Jack Jia;Weidong Le;;Molecular network of neuronal autophagy in the pathophysiology and treatment of depression[J];Neuroscience Bulletin;2015年04期

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本文編號：666058