本文關(guān)鍵詞：口服雷帕霉素酵母微囊遞送系統(tǒng)在靶向治療動脈粥樣硬化中的研究

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【摘要】：動脈粥樣硬化(AS)與多種心腦血管疾病如心肌梗死、腦梗死、腎缺血、間歇性跛行等有密切且直接的關(guān)系。近期研究表明,通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、選擇性清除巨噬細(xì)胞以及其抗炎等多種作用,免疫抑制藥物雷帕霉素(Rapamycin,RAP)及其衍生物能夠減小AS斑塊面積、改善斑塊組成、并顯著提高斑塊穩(wěn)定性,進(jìn)而有效抑制AS發(fā)展。然而,目前的RAP制劑多為系統(tǒng)性給藥,其血漿半衰期短,迅速從靶部位消除,導(dǎo)致AS斑塊部位藥物難以維持最低有效治療濃度;藥物均勻分布于各組織器官,無特異性導(dǎo)致全身毒副作用;故治療效果十分有限,即使提高給藥劑量也很難達(dá)到理想療效。因此,開發(fā)有效性高、毒副作用低、患者依從性好的具有靶向性能的口服RAP藥物遞送系統(tǒng),對治療AS具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過仿生途徑,利用去除內(nèi)容物的酵母微囊可以通過口服途徑靶向至腫瘤部位及急性炎癥部位。因此,在本課題中,通過類似的原理,模仿病菌通過腸道侵染機(jī)體的途徑,利用酵母微囊作為載體,構(gòu)建了用于治療AS的口服RAP靶向遞送系統(tǒng)。方法1.空白酵母微囊的制備稱取一定量的啤酒酵母,經(jīng)酸、堿、有機(jī)溶劑等處理后除去內(nèi)容物,干燥后即得空白酵母微囊(YC)。2.酵母微囊對不同粒徑的納米粒的負(fù)載性能評價稱取一定量的YC用p H 9.2碳酸鹽緩沖液制備成混懸液,于37℃孵育30 min后,加入枝化聚乙烯亞胺(PEI),其中YC/PEI質(zhì)量比為2:1,孵育過夜,離心水洗多次后,重懸液加入不同粒徑的羧基修飾的聚苯乙烯納米粒,37℃孵育8 h,離心水洗后,用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及透射電子顯微鏡(TEM)對酵母微囊負(fù)載納米粒情況進(jìn)行表征。3.雷帕霉素納米粒的制備及表征稱取一定量的pei?含羧基小分子藥物及疏水性藥物雷帕霉素(rap)共溶于二甲基亞砜(dmso)中,置于透析袋中,在純水中透析24h后即得rap納米粒(rapnp)?測定其粒徑大小及表面電位,利用tem對納米粒的形貌進(jìn)行表征。4.雷帕霉素酵母微囊的制備及表征稱取一定量的yc用水制備成混懸液,于40℃混懸孵育30min后加入rapnp混懸液,25℃混懸孵育過夜后,離心水洗后,凍干即得雷帕霉素酵母微囊(yc/rap)。測定其表面電位,用高效液相色譜法(hplc)測定載藥量,tem及clsm對納米粒在酵母微囊內(nèi)部的包埋情況進(jìn)行觀察。5.雷帕霉素酵母微囊的體外釋放評價配制ph1.2及ph7.4的磷酸鹽緩沖液分別模擬胃腸道酸堿環(huán)境,將載藥酵母微囊置于此模擬環(huán)境及rpmi1640培養(yǎng)基中,于特定時間離心取上清液。用hplc測定rap的釋放量。6.巨噬細(xì)胞對yc的吞噬性能評價將5-(4,6-二氯三嗪基)氨基熒光素(dtaf)標(biāo)記的yc(yc/dtaf)與raw264.7細(xì)胞共孵育不同時間,清洗掉未吞噬的yc/dtaf后,溶酶體及細(xì)胞核染色,利用clsm和流式細(xì)胞儀對yc被巨噬細(xì)胞吞噬的情況進(jìn)行評價。7.巨噬細(xì)胞對yc/rap的吞噬及藥物胞內(nèi)保留特性評價將巨噬細(xì)胞種植于孔板,加入yc/rap孵育不同時間后,pbs清洗,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,離心取上清,測定總蛋白含量,用hplc測定溶液中rap濃度。8.口服酵母微囊對動脈粥樣硬化斑塊的靶向作用研究首先通過化學(xué)反應(yīng)將近紅外熒光花青染料7.5(cy7.5)化學(xué)鍵合到pei上面,用純水透析后制備得到cy7.5納米粒(cy7.5nps),然后將yc混懸液與cy7.5nps孵育得到熒光標(biāo)記的酵母微囊(yc/cy7.5)。載脂蛋白e缺陷(apoe-/-)小鼠給予高脂飲食建立動脈粥樣硬化模型,分別口服灌胃給予cy7.5nps或yc/cy7.5連續(xù)4天后,于第5天解剖取主動脈及各臟器組織,剝離脂肪后用活體成像觀察并統(tǒng)計熒光強(qiáng)度。9.口服酵母微囊靶向動脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的初步研究基于apoe-/-小鼠建立as模型,口服灌注yc/dtaf連續(xù)兩天后,于第3天解剖取主動脈及脾臟,分離巨噬細(xì)胞,免疫熒光染色后,用clsm觀察。10.口服載藥酵母微囊治療動脈粥樣硬化的藥效學(xué)評價以apoe-/-小鼠建立as模型,口服給予生理鹽水、yc、rap、rapnp及yc/rap,每三天一次,給藥2個月后,取主動脈用油紅o染色評價斑塊生長情況;主動脈根部切片進(jìn)行免疫組化染色后評價斑塊、膠原等分布情況;取全血用流式細(xì)胞術(shù)測定單核巨噬細(xì)胞比例。11.口服載藥酵母微囊治療動脈粥樣硬化的初步安全性研究取全血測定血常規(guī);取血清測定血脂水平、腎功能、肝功能等;取血清測定炎性因子及活性氧水平;取主動脈研磨后測定組織炎性因子及活性氧含量;取各臟器稱重計算臟器指數(shù);取各臟器及胃腸道進(jìn)行切片并做he染色觀察臟器組織病理形態(tài)。結(jié)果1.基于靜電相互作用,pei預(yù)處理的yc能夠負(fù)載不同粒徑大小的負(fù)電荷納米粒,其最大粒徑為750nm。2.基于同樣的靜電作用介導(dǎo)的自沉積過程,通過簡單的混懸過程,yc能夠成功負(fù)載正電荷的納米粒,clsm及tem觀察顯示,納米粒分散于酵母微囊的內(nèi)部。hplc測定表明yc/rap載藥量為1.0-4.5%,載藥量與混懸孵育的時間及溫度相關(guān)。3.yc/rap在ph1.2酸性介質(zhì)中藥物釋放緩慢,而在ph7.4的環(huán)境下藥物釋放較為迅速。4.酵母微囊能夠被巨噬細(xì)胞迅速吞噬,并且呈時間依賴性。同樣,載藥酵母微囊可被巨噬細(xì)胞吞噬,其藥物rap在胞內(nèi)保留時間較長。5.活體成像結(jié)果顯示,yc/cy7.5經(jīng)口服后能夠顯著提高cy7.5在動脈粥樣硬化斑塊部位的富集,分析各臟器組織熒光強(qiáng)度可以發(fā)現(xiàn),在淋巴相關(guān)的腸系膜淋巴結(jié)、胸腺及小腸部位的熒光強(qiáng)度亦有顯著增加。6.分離小鼠的脾臟及主動脈組織的巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)酵母微囊主要分布于巨噬細(xì)胞內(nèi)部。7.油紅o染色顯示,口服yc/rap后能夠使apoe-/-小鼠的as斑塊的比例顯著降低,血清中相關(guān)促炎因子及活性氧水平顯著降低。8.初步安全性評價表明血液生理指標(biāo)、肝腎功能均無顯著差異,臟器組織及胃腸道切片無明顯病理變化。結(jié)論1.基于靜電作用,yc能夠負(fù)載的納米粒的最大粒徑為~750nm。通過自組裝制備的帶有正電荷的rap納米粒,可以成功負(fù)載于yc內(nèi)部。2.巨噬細(xì)胞能夠有效吞噬載rap酵母微囊。3.口服給藥后,yc能夠靶向至小鼠動脈粥樣硬化斑塊部位,此過程與淋巴系統(tǒng)及組織關(guān)系密切。單核巨噬細(xì)胞在靶向過程中可能發(fā)揮重要的作用。4.口服YC/RAP能夠有效降低AS斑塊的生長,且副作用較低。綜上所述,本課題模擬病菌通過腸道途徑侵染機(jī)體的過程,以酵母微囊作為藥物載體,構(gòu)建了用于治療AS的口服靶向性RAP遞送系統(tǒng),有望開發(fā)成為一種新型AS治療藥物。
【關(guān)鍵詞】：動脈粥樣硬化 口服靶向 酵母微囊 仿生 藥物遞送
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 雷帕霉素酵母微囊的制備及其理化性能表征18-32
• 2.1 雷帕霉素酵母微囊的制備及其表征18-28
• 2.1.1 材料與方法18-22
• 2.1.2 結(jié)果22-27
• 2.1.3 討論27-28
• 2.2 雷帕霉素酵母微囊的體外釋放行為評價28-31
• 2.2.1 材料與方法28-30
• 2.2.2 結(jié)果30-31
• 2.2.3 討論31
• 2.3 本章小結(jié)31-32
• 第三章 口服酵母微囊靶向動脈粥樣硬化的特性及機(jī)制研究32-52
• 3.1 巨噬細(xì)胞對酵母微囊的胞內(nèi)攝取及其機(jī)制研究32-38
• 3.1.1 材料與方法32-35
• 3.1.2 結(jié)果35-37
• 3.1.3 討論37-38
• 3.2 口服酵母微囊對動脈粥樣硬化斑塊的靶向特性評價38-44
• 3.2.1 材料與方法38-40
• 3.2.2 結(jié)果40-44
• 3.2.3 討論44
• 3.3 酵母微囊靶向動脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制研究44-51
• 3.3.1 材料與方法44-48
• 3.3.2 結(jié)果48-50
• 3.3.3 討論50-51
• 3.4 本章小結(jié)51-52
• 第四章 口服雷帕霉素酵母微囊治療動脈粥樣硬化的藥效學(xué)及安全性評價52-69
• 4.1 口服雷帕霉素酵母微囊治療動脈粥樣硬化的藥效學(xué)評價52-63
• 4.1.1 材料與方法52-56
• 4.1.2 結(jié)果56-62
• 4.1.3 討論62-63
• 4.2 口服雷帕霉素酵母微囊的初步安全性評價63-68
• 4.2.1 材料與方法63-65
• 4.2.2 結(jié)果65-68
• 4.2.3 討論68
• 4.3 全章小結(jié)68-69
• 全文結(jié)論69-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 文獻(xiàn)綜述 仿生化藥物載體在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用76-92
• 參考文獻(xiàn)85-92
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果92-93
• 致謝93-95

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