本文關(guān)鍵詞：狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽防治地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松作用研究

  更多相關(guān)文章： 狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽 地塞米松 大鼠 骨質(zhì)疏松

【摘要】：目的:復(fù)制地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型和成骨細(xì)胞損傷模型,研究狹鱈魚(yú)皮膠原肽對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的方法,確認(rèn)小分子肽的生物活性。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將100只8周齡wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組,預(yù)防給藥組(造模4周前給藥膠原蛋白肽1g/kg/d,連續(xù)給藥23周)治療組(造模6周后給藥膠原蛋白肽0.5g、1g/kg/d,連續(xù)用藥13周)地塞米松損傷組,正常對(duì)照組;除正常對(duì)照組外,其余各組在大鼠12周齡時(shí),每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉注射液1.0 mg/kg,對(duì)大鼠股骨X光經(jīng)時(shí)攝片(10、16、23周),經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,ELISA法同期檢測(cè)BALP、PINP、CTX-1、TRAP含量,HE染色經(jīng)時(shí)測(cè)量骨小梁面積的百分比和骨皮質(zhì)厚度,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TGF-β的表達(dá)。高效液相色譜方法為:色譜柱venusic ASB-C18(250mm×4.6mm,5um),柱溫:40℃;流動(dòng)相:乙腈和純水梯度洗脫;流速:1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):220nm。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):建立并鑒定大鼠顱骨源成骨細(xì)胞,復(fù)制地塞米松損傷模型,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):正常組、地塞米松損傷組、膠原蛋白肽(100、200和400 ug/ml)組、三肽(200 ug/ml)組、RU486地塞米松拮抗劑組,采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率;Western blotting法檢測(cè)骨鈣蛋白(OCN)的表達(dá)。結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):成功復(fù)制了地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型,經(jīng)X光片灰度值分析,模型組(64.49±2.71)較正常組(109.23±1.48)顯著降低(P0.01),并持續(xù)穩(wěn)定至實(shí)驗(yàn)期末,膠原蛋白肽預(yù)防組(連續(xù)給藥10周)灰度值較同期模型組升高,且隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)遞增,兩個(gè)劑量治療組(連續(xù)給藥6周)灰度值均升高,給藥13周時(shí)分別升至76和84左右(P0.01),大劑量治療效果好于小劑量組。骨關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果表明,模型組骨小梁數(shù)量減少,其面積百分比較正常組下降50%,且連接間隙較大,空腔面積亦擴(kuò)大,還可見(jiàn)部分骨皮質(zhì)斷裂,骨皮質(zhì)厚度呈現(xiàn)不同程度的變薄。預(yù)防組連續(xù)給藥16周時(shí),骨組織學(xué)觀察指標(biāo)改善,骨小梁面積百分比由47%升至56%,較模型組35%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),且隨增時(shí)骨病理組織學(xué)指標(biāo)進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。大小劑量治療組對(duì)骨形態(tài)指標(biāo)的影響均較同期模型組升高,也呈時(shí)間依賴性,以大劑量組治療效果為佳。免疫組織化學(xué)經(jīng)時(shí)檢測(cè)TGF-β平均積分光密度發(fā)現(xiàn),模型組較正常組降低,差異具有顯著性,膠原蛋白肽預(yù)防給藥10周大鼠TGF-β1平均積分光密度值升高,并呈經(jīng)時(shí)性升高,成模后經(jīng)大小劑量治療6周該光密度積分值開(kāi)始升高,也呈經(jīng)時(shí)性增加(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,模型組血清骨形成指標(biāo)BALP、PINP的含量較正常組顯著降低(p0.01),膠原蛋白肽各給藥組均較模型組呈時(shí)間依賴性升高(p0.05),模型組血清骨吸收CTX-1、TRAP較正常組的含量升高,膠原蛋白肽防治各組均較模型組經(jīng)時(shí)性降低(p0.05)。高效液相色譜法:檢測(cè)Pro-Hyp的濃度在0.005mg/ml~0.5 mg/ml(R2=0.9999)、Gly-Pro-Hyp的濃度在0.01 mg/ml~1 mg/ml(R2=0.9998),線性關(guān)系良好;Pro-Hyp(低、中、高濃度)的平均回收率分別為99.26%、98.77和99.07,RSD分別為1.71,2.63和2.33;Gly-Pro-Hyp(低、中、高濃度)的平均回收率分別為98.89%,98.22%和99.57%,RSD分別為1.70,1.20和0.84。表明Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的加樣回收率良好。正常組Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp含量分別為0.096、0.079(mg/ml),模型組血清小分子肽含量明顯降低,分別為0.029、0.044(mg/ml),預(yù)防給藥組小分子肽含量較模型組顯著升高,為0.148、0.107(p0.01)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):經(jīng)10-5mol/L地塞米松損傷48h后成功復(fù)制成骨細(xì)胞損傷模型,狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽三個(gè)劑量能提高成骨細(xì)胞存活率為70%,但組間無(wú)顯著差異(P0.05),三肽組作用高達(dá)139%(P0.01)。Western Blot檢測(cè)到膠原蛋白肽和三肽組骨鈣蛋白表達(dá)量也較模型組顯著升高,以三肽組作用最為顯著。結(jié)論:狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽在實(shí)驗(yàn)劑量下能呈時(shí)間依賴性防治大鼠地塞米松性骨質(zhì)疏松;大鼠血清Gly-Pro-Hyp和Pro-Hyp的含量與骨質(zhì)疏松呈負(fù)相關(guān),膠原蛋白肽抗骨質(zhì)疏松作用可能與在小分子活性小肽有關(guān);狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽和三肽均能直接促進(jìn)顱骨源成骨細(xì)胞的增殖和成熟,其中以三肽效佳。
【關(guān)鍵詞】：狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽 地塞米松 大鼠 骨質(zhì)疏松
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R965
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 英文縮略表6-9
• 引言9-11
• 第一章 試劑和儀器11-13
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞11
• 1.2 實(shí)驗(yàn)用品與試劑11-12
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器12-13
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法13-19
• 2.1 大鼠飼養(yǎng)、分組與組織處理13-15
• 2.1.1 大鼠飼養(yǎng)13
• 2.1.2 大鼠分組和造模13
• 2.1.3 大鼠骨組織處理和血樣的提取13
• 2.1.4 大鼠股骨密度檢測(cè)13-14
• 2.1.5 大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色14
• 2.1.6 大鼠膝關(guān)節(jié)TGF-β 免疫組織化學(xué)法染色14-15
• 2.1.7 大鼠血液上清BALP、PINP、CTX-1 和TRAP指標(biāo)檢測(cè)15
• 2.2 灌胃狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽后大鼠血清中Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp含量的測(cè)定15
• 2.2.1 色譜條件15
• 2.2.2 檢測(cè)方法15
• 2.3 顱骨源成骨細(xì)胞的提取和鑒定、分組、細(xì)胞上清和蛋白提取15-19
• 2.3.1 成骨細(xì)胞的提取和鑒定15-16
• 2.3.2 地塞米松致成骨細(xì)胞損傷模型建立16-17
• 2.3.3 細(xì)胞分組17
• 2.3.4 細(xì)胞上清和蛋白的提取17
• 2.3.5 狹鱈魚(yú)皮膠原肽對(duì)地塞米松致成骨細(xì)胞損傷的存活率影響檢測(cè)17
• 2.3.6 細(xì)胞骨鈣蛋白（OCN）蛋白免疫印跡法檢測(cè)17-19
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析19
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-42
• 3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-30
• 3.1.1 各實(shí)驗(yàn)周期大鼠股骨灰度值分析結(jié)果19-21
• 3.1.2 各組大鼠骨關(guān)節(jié)經(jīng)時(shí)變化骨小梁百分比分析結(jié)果21-23
• 3.1.3 狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)大鼠骨皮質(zhì)相對(duì)厚度的經(jīng)時(shí)影響23-24
• 3.1.4 狹鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽對(duì)大鼠股骨TGF-β 表達(dá)影響24-25
• 3.1.5 大鼠血液上清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果25-30
• 3.2 高效液相色譜法血清中Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp樣品方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果30-37
• 3.2.1 線性關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果30-32
• 3.2.2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果32-33
• 3.2.3 樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果33
• 3.2.4 加樣回收率驗(yàn)證結(jié)果33-34
• 3.2.5 血清Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp含量的測(cè)定結(jié)果34-37
• 3.3 成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 3.3.1 正常成骨細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)37
• 3.3.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果37-38
• 3.3.3 成骨細(xì)胞免疫組化結(jié)果38
• 3.3.4 不同濃度地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞存活率的影響結(jié)果38-39
• 3.3.5 膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞存活率作用檢測(cè)結(jié)果39-40
• 3.3.6 成骨細(xì)胞分泌的OCN蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果40-42
• 第四章 討論42-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-76
• 綜述參考文獻(xiàn)70-76
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果76-77
• 致謝77-78

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