本文關(guān)鍵詞：狹鱈魚皮膠原蛋白肽防治地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松作用研究

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【摘要】：目的:復(fù)制地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型和成骨細(xì)胞損傷模型,研究狹鱈魚皮膠原肽對骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。建立高效液相色譜法同時檢測Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的方法,確認(rèn)小分子肽的生物活性。方法:動物實驗:將100只8周齡wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組,預(yù)防給藥組(造模4周前給藥膠原蛋白肽1g/kg/d,連續(xù)給藥23周)治療組(造模6周后給藥膠原蛋白肽0.5g、1g/kg/d,連續(xù)用藥13周)地塞米松損傷組,正常對照組;除正常對照組外,其余各組在大鼠12周齡時,每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉注射液1.0 mg/kg,對大鼠股骨X光經(jīng)時攝片(10、16、23周),經(jīng)腹主動脈取血,ELISA法同期檢測BALP、PINP、CTX-1、TRAP含量,HE染色經(jīng)時測量骨小梁面積的百分比和骨皮質(zhì)厚度,免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β的表達(dá)。高效液相色譜方法為:色譜柱venusic ASB-C18(250mm×4.6mm,5um),柱溫:40℃;流動相:乙腈和純水梯度洗脫;流速:1.0ml/min;檢測波長:220nm。細(xì)胞實驗:建立并鑒定大鼠顱骨源成骨細(xì)胞,復(fù)制地塞米松損傷模型,實驗設(shè)計:正常組、地塞米松損傷組、膠原蛋白肽(100、200和400 ug/ml)組、三肽(200 ug/ml)組、RU486地塞米松拮抗劑組,采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的存活率;Western blotting法檢測骨鈣蛋白(OCN)的表達(dá)。結(jié)果:動物實驗:成功復(fù)制了地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松模型,經(jīng)X光片灰度值分析,模型組(64.49±2.71)較正常組(109.23±1.48)顯著降低(P0.01),并持續(xù)穩(wěn)定至實驗期末,膠原蛋白肽預(yù)防組(連續(xù)給藥10周)灰度值較同期模型組升高,且隨給藥時間延長遞增,兩個劑量治療組(連續(xù)給藥6周)灰度值均升高,給藥13周時分別升至76和84左右(P0.01),大劑量治療效果好于小劑量組。骨關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果表明,模型組骨小梁數(shù)量減少,其面積百分比較正常組下降50%,且連接間隙較大,空腔面積亦擴(kuò)大,還可見部分骨皮質(zhì)斷裂,骨皮質(zhì)厚度呈現(xiàn)不同程度的變薄。預(yù)防組連續(xù)給藥16周時,骨組織學(xué)觀察指標(biāo)改善,骨小梁面積百分比由47%升至56%,較模型組35%差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),且隨增時骨病理組織學(xué)指標(biāo)進(jìn)一步好轉(zhuǎn)。大小劑量治療組對骨形態(tài)指標(biāo)的影響均較同期模型組升高,也呈時間依賴性,以大劑量組治療效果為佳。免疫組織化學(xué)經(jīng)時檢測TGF-β平均積分光密度發(fā)現(xiàn),模型組較正常組降低,差異具有顯著性,膠原蛋白肽預(yù)防給藥10周大鼠TGF-β1平均積分光密度值升高,并呈經(jīng)時性升高,成模后經(jīng)大小劑量治療6周該光密度積分值開始升高,也呈經(jīng)時性增加(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,模型組血清骨形成指標(biāo)BALP、PINP的含量較正常組顯著降低(p0.01),膠原蛋白肽各給藥組均較模型組呈時間依賴性升高(p0.05),模型組血清骨吸收CTX-1、TRAP較正常組的含量升高,膠原蛋白肽防治各組均較模型組經(jīng)時性降低(p0.05)。高效液相色譜法:檢測Pro-Hyp的濃度在0.005mg/ml~0.5 mg/ml(R2=0.9999)、Gly-Pro-Hyp的濃度在0.01 mg/ml~1 mg/ml(R2=0.9998),線性關(guān)系良好;Pro-Hyp(低、中、高濃度)的平均回收率分別為99.26%、98.77和99.07,RSD分別為1.71,2.63和2.33;Gly-Pro-Hyp(低、中、高濃度)的平均回收率分別為98.89%,98.22%和99.57%,RSD分別為1.70,1.20和0.84。表明Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的加樣回收率良好。正常組Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp含量分別為0.096、0.079(mg/ml),模型組血清小分子肽含量明顯降低,分別為0.029、0.044(mg/ml),預(yù)防給藥組小分子肽含量較模型組顯著升高,為0.148、0.107(p0.01)。細(xì)胞實驗:經(jīng)10-5mol/L地塞米松損傷48h后成功復(fù)制成骨細(xì)胞損傷模型,狹鱈魚皮膠原蛋白肽三個劑量能提高成骨細(xì)胞存活率為70%,但組間無顯著差異(P0.05),三肽組作用高達(dá)139%(P0.01)。Western Blot檢測到膠原蛋白肽和三肽組骨鈣蛋白表達(dá)量也較模型組顯著升高,以三肽組作用最為顯著。結(jié)論:狹鱈魚皮膠原蛋白肽在實驗劑量下能呈時間依賴性防治大鼠地塞米松性骨質(zhì)疏松;大鼠血清Gly-Pro-Hyp和Pro-Hyp的含量與骨質(zhì)疏松呈負(fù)相關(guān),膠原蛋白肽抗骨質(zhì)疏松作用可能與在小分子活性小肽有關(guān);狹鱈魚皮膠原蛋白肽和三肽均能直接促進(jìn)顱骨源成骨細(xì)胞的增殖和成熟,其中以三肽效佳。
【關(guān)鍵詞】：狹鱈魚皮膠原蛋白肽 地塞米松 大鼠 骨質(zhì)疏松
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 英文縮略表6-9
• 引言9-11
• 第一章 試劑和儀器11-13
• 1.1 實驗動物和細(xì)胞11
• 1.2 實驗用品與試劑11-12
• 1.3 實驗儀器12-13
• 第二章 實驗方法13-19
• 2.1 大鼠飼養(yǎng)、分組與組織處理13-15
• 2.1.1 大鼠飼養(yǎng)13
• 2.1.2 大鼠分組和造模13
• 2.1.3 大鼠骨組織處理和血樣的提取13
• 2.1.4 大鼠股骨密度檢測13-14
• 2.1.5 大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色14
• 2.1.6 大鼠膝關(guān)節(jié)TGF-β 免疫組織化學(xué)法染色14-15
• 2.1.7 大鼠血液上清BALP、PINP、CTX-1 和TRAP指標(biāo)檢測15
• 2.2 灌胃狹鱈魚皮膠原蛋白肽后大鼠血清中Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp含量的測定15
• 2.2.1 色譜條件15
• 2.2.2 檢測方法15
• 2.3 顱骨源成骨細(xì)胞的提取和鑒定、分組、細(xì)胞上清和蛋白提取15-19
• 2.3.1 成骨細(xì)胞的提取和鑒定15-16
• 2.3.2 地塞米松致成骨細(xì)胞損傷模型建立16-17
• 2.3.3 細(xì)胞分組17
• 2.3.4 細(xì)胞上清和蛋白的提取17
• 2.3.5 狹鱈魚皮膠原肽對地塞米松致成骨細(xì)胞損傷的存活率影響檢測17
• 2.3.6 細(xì)胞骨鈣蛋白（OCN）蛋白免疫印跡法檢測17-19
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)分析19
• 第三章 實驗結(jié)果19-42
• 3.1 動物實驗結(jié)果19-30
• 3.1.1 各實驗周期大鼠股骨灰度值分析結(jié)果19-21
• 3.1.2 各組大鼠骨關(guān)節(jié)經(jīng)時變化骨小梁百分比分析結(jié)果21-23
• 3.1.3 狹鱈魚皮膠原蛋白肽對大鼠骨皮質(zhì)相對厚度的經(jīng)時影響23-24
• 3.1.4 狹鱈魚皮膠原蛋白肽對大鼠股骨TGF-β 表達(dá)影響24-25
• 3.1.5 大鼠血液上清指標(biāo)檢測結(jié)果25-30
• 3.2 高效液相色譜法血清中Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp樣品方法學(xué)驗證結(jié)果30-37
• 3.2.1 線性關(guān)系驗證結(jié)果30-32
• 3.2.2 重復(fù)性驗證結(jié)果32-33
• 3.2.3 樣品穩(wěn)定性驗證結(jié)果33
• 3.2.4 加樣回收率驗證結(jié)果33-34
• 3.2.5 血清Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp含量的測定結(jié)果34-37
• 3.3 成骨細(xì)胞實驗結(jié)果37-42
• 3.3.1 正常成骨細(xì)胞生長形態(tài)37
• 3.3.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果37-38
• 3.3.3 成骨細(xì)胞免疫組化結(jié)果38
• 3.3.4 不同濃度地塞米松對成骨細(xì)胞存活率的影響結(jié)果38-39
• 3.3.5 膠原蛋白肽對成骨細(xì)胞存活率作用檢測結(jié)果39-40
• 3.3.6 成骨細(xì)胞分泌的OCN蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果40-42
• 第四章 討論42-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-76
• 綜述參考文獻(xiàn)70-76
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果76-77
• 致謝77-78

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