本文關(guān)鍵詞：P2X7受體阻滯劑對氧化應(yīng)激所致紅細胞損傷的保護機制

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【摘要】：背景氧化應(yīng)激在很多生理和病理現(xiàn)象中扮演重要的角色。紅細胞--維持生命活動最重要的細胞之一,因為它對氧化應(yīng)激高度的易損性,已經(jīng)被用作為模型來研究生物膜的氧化損傷。P2X7受體(P2X7 receptor,P2X7R),是三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)敏感的嘌呤受體,可被細胞外ATP激活。P2X7受體的激活可導(dǎo)致非選擇性陽離子的快速流通,最終引起細胞的腫脹破裂,即溶血。因此,研究P2X7受體在氧化應(yīng)激所致紅細胞損傷中的作用機制,為氧化應(yīng)激所致紅細胞損傷的保護性研究提供了新的思路和方法。目的1通過用不同濃度的對偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2,2-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH]處理紅細胞,觀察AAPH對紅細胞的影響。2通過用P2X7受體阻斷劑亮藍G(Brilliant Blue G,BBG)對AAPH所致的紅細胞損傷進行保護,探討氧化應(yīng)激所致的紅細胞損傷與P2X7受體之間的聯(lián)系。3利用酶標(biāo)儀檢測技術(shù)、熒光顯微鏡檢測技術(shù)、流式細胞儀檢測技術(shù)檢測紅細胞損傷的評價指標(biāo)[溶血率、滲透脆性、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻、細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度],探討P2X7受體在氧化應(yīng)激所致紅細胞損傷中的作用機制。方法1取清潔級正常雄性Wistar大鼠的紅細胞,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)配成6.25%的紅細胞懸液,用不同濃度的AAPH(10mmol/l、30mmol/l、50mmol/l、80mmol/l、100mmol/l)進行處理,在37℃的恒溫水浴鍋中孵育。分別在孵育后的不同時間點(30min、60min、90min、120min、150min、180min)取樣,用酶標(biāo)儀檢測誘導(dǎo)樣品的上清液中血紅蛋白在540 nm處的吸光度值(OD值)。樣品在去離子水中完全溶血時所釋放的血紅蛋白在540 nm處的吸光度值(OD值)作為基礎(chǔ)值,計算樣品在PBS溶液中的溶血率,公式為:溶血率(%)=(OD值_(PBS溶液)-OD值_(純PBS溶液))/(OD值_(去離子水)-OD值_(純?nèi)ルx子水溶液))×100%。2通過AAPH對紅細胞損傷的時間依賴性和濃度依賴性曲線,選擇一個合適的損傷濃度來引發(fā)紅細胞的氧化損傷。同時用不同濃度的BBG(0.1 umol/l、0.3 umol/l、0.5 umol/l、1 umol/l、3 umol/l、5 umol/l、10 umol/l)進行干預(yù)保護。在37℃恒溫水浴鍋中孵育1.5 h后取樣,用酶標(biāo)儀檢測誘導(dǎo)樣品的上清液中血紅蛋白在540nm處的吸光度(OD值)。樣品在去離子水中完全溶血時所釋放的血紅蛋白在540nm的吸光度值(OD值)作為基礎(chǔ)值,計算樣品在PBS溶液中的溶血率,公式為:溶血率(%)=(OD值_(PBS溶液)-OD值_(純PBS溶液))/(OD值_(去離子水)-OD值_(純?nèi)ルx子水溶液))×100%。3通過前期的研究結(jié)果,選擇一個合適的損傷濃度和保護濃度,從4個方面研究BBG對AAPH所致紅細胞損傷的保護機制,即溶血率、滲透脆性、PS外翻、細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度變化。紅細胞的溶血率利用樣品中血紅蛋白在540 nm處的吸光度值(OD值)來表示,即用酶標(biāo)儀檢測技術(shù)檢測誘導(dǎo)樣品上清液的血紅蛋白的吸光度值,并以紅細胞在去離子水中全部溶血時所釋放的血紅蛋白的吸光度值作為基礎(chǔ)值,計算誘導(dǎo)樣品紅細胞在PBS溶液中的溶血率;利用紅細胞在不同濃度NaCl緩沖鹽溶液(0.3%、0.4%、0.9%,pH=7.4)的抵抗力的不同,檢測紅細胞的滲透脆性;用Annexin V-FITC標(biāo)記PS外翻的紅細胞,利用倒置熒光顯微鏡直觀觀察樣品中紅細胞PS外翻情況;用FLUO-3/AM標(biāo)記紅細胞內(nèi)的Ca~(2+),利用熒光顯微鏡技術(shù)和流式細胞儀檢測技術(shù),來直觀和定量的觀察紅細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的變化。結(jié)果1與正常對照組(AAPH濃度為0 mmol/l)相比,AAPH組(10 mmol/l、30 mmol/l、50 mmol/l、80 mmol/l、100 mmol/l)發(fā)生不同程度的溶血現(xiàn)象(P0.05),而且在同一時間點,AAPH濃度越大,溶血現(xiàn)象越明顯;同一濃度,隨著時間的增大,溶血現(xiàn)象越明顯。2當(dāng)BBG保護濃度5umol/l時(0.1 umol/l、0.3 umol/l、0.5 umol/l、1 umol/l、3 umol/l),它對AAPH所致紅細胞溶血并沒有明顯的保護作用;當(dāng)BBG保護濃度為5 umol/l或10 umol/l時,它可使AAPH所引發(fā)的紅細胞溶血現(xiàn)象明顯減輕,溶血率明顯下降(P0.05)。3與正常對照組相比,AAPH組:溶血率增加(t=4.242,P0.01),滲透脆性增加(t=16.88,P0.01),PS外翻的紅細胞數(shù)量明顯增多(t=10.307,P0.01),紅細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度增加(t=9.407,P0.01)。用BBG進行干預(yù)保護后,與AAPH組相比,AAPH+BBG組:溶血率減少(t=3.582,P0.05),滲透脆性降低(t=4.766,P0.05),PS外翻的紅細胞數(shù)量明顯減少(t=3.504,P0.05),紅細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度降低(t=4.076,P0.05)。結(jié)論1氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)紅細胞的氧化損傷,這種損傷呈時間依賴性和濃度依賴性增加。2 P2X7受體參與氧化應(yīng)激所致的紅細胞損傷,且P2X7受體阻滯劑可有效抑制這種損傷。3 P2X7受體阻滯劑通過抑制P2X7受體激活,減少紅細胞內(nèi)Ca~(2+)內(nèi)流,減少紅細胞PS外翻的數(shù)量,降低紅細胞滲透脆性,來抵抗氧化應(yīng)激對紅細胞造成的損傷。
【關(guān)鍵詞】：紅細胞 氧化應(yīng)激 P2X7受體 Ca~(2+)
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-16
• 第一部分 AAPH對紅細胞的影響16-20
• 材料與方法16-18
• 結(jié)果18-20
• 第二部分 BBG對AAPH所致紅細胞氧化損傷的影響20-24
• 材料與方法20-23
• 結(jié)果23-24
• 第三部分 BBG對AAPH所致紅細胞氧化損傷的保護機制24-35
• 材料和方法24-30
• 結(jié)果30-35
• 討論35-38
• 小結(jié)38-39
• 參考文獻39-45
• 綜述：P2X7受體在紅細胞損傷機制中的研究進展45-63
• 參考文獻56-63
• 附錄 1：附圖63-64
• 附錄 2：英文縮略詞64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況65-66
• 致謝66-67
• 個人簡歷67

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