本文關(guān)鍵詞：Myrothecine A通過miR-221調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及樹突狀細(xì)胞成熟機(jī)制的研究

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【摘要】：Myrothecine A是從黃花蒿內(nèi)生真菌Myrothecium roridum IFB-E012發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的、具有細(xì)胞毒性的10,13環(huán)單端孢霉烯型大環(huán)內(nèi)酯類化合物。已有文獻(xiàn)報(bào)道了該化合物的絕對構(gòu)型,并初步探討了其在內(nèi)共生和生物催化方面的潛在意義。本論文旨在探討myrothecine A體外抗腫瘤的初步機(jī)制以及它在免疫調(diào)節(jié)方面的作用。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-221是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)者,它能與其靶基因的3’UTR區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平對基因進(jìn)行調(diào)控,起著癌基因的作用,廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)抗原遞呈功能最強(qiáng)大的細(xì)胞,是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn),miRNAs能廣泛參與DC發(fā)育、分化、成熟等過程。因此,本論文從以下兩個(gè)方面探討myrothecine A對miR-221的調(diào)節(jié)作用以及對肝癌細(xì)胞增殖和DC成熟的影響：一、研究myrothecine A通過miR-221對肝癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制；二、觀察myrothecine A通過miR-221對DC成熟的影響,以期為myrothecine A成為新的抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先,我們研究myrothecine A通過miR-221對肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。我們用不同濃度的myrothecine A處理人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721, MTT法檢測肝癌細(xì)胞的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)myrothecine A濃度達(dá)到1 μg/mL時(shí),能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖,并且隨著濃度的增加,myrothecine A對肝癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑景依賴性。接下來,我們使用不同濃度的myrothecine A分別處理人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721后,采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期,結(jié)果顯示,myrothecine A能將細(xì)胞阻滯在S期。為了進(jìn)一步探討myrothecine A誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞S期阻滯及抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們建立了miR-221過表達(dá)細(xì)胞模型,然后觀察myrothecine A是否可通過miR-221抑制肝癌細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后,SMMC-7721細(xì)胞中miR-221的表達(dá)明顯增高,相比于對照組,miR-221能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。然后,加入1 μg/mL myrothecine A后,這種促進(jìn)作用能明顯被抑制,表明myrothecine A能逆轉(zhuǎn)miR-221引起的肝癌細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探討其機(jī)制,我們用1μg/mL myrothecine A處理miR-221過表達(dá)的肝癌細(xì)胞株SMMC-7721,24h后,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-221的表達(dá)水平,并用Western blot檢測miR-221的靶基因p27kipl(下文記作p27)的表達(dá)。結(jié)果顯示,myrothecine A能顯著抑制miR-221的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后,p27的表達(dá)水平明顯下降。但加入1 μg/mL myrothecine A后,p27的表達(dá)水平可明顯增加。以上結(jié)果說明,myrothecine A能通過抑制miR-221的表達(dá)而影響p27的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖。其次,我們觀察myrothecine A通過miR-221對DC成熟的影響。在DC成熟過程中,抗原遞呈能力逐漸增強(qiáng),并高水平表達(dá)表面共刺激分子,如CD86、CD40、CD80等,因此,我們首先將未成熟的小鼠DC與miR-221過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Hepal-6(小鼠肝癌細(xì)胞株)共培養(yǎng),用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CD86和CD40分子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,miR-221過表達(dá)能顯著抑制DC表面CD86和CD40的表達(dá),表明miR-221可抑制DC的成熟。接下來,我們在未成熟的小鼠DC與miR-221過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Hepal-6共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,又加入1 μg/mL myrothecine A,作用24h后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入myrothecine A后,DC表面CD86和CD40分子的表達(dá)都有不同程度的增加,提示myrothecineA能逆轉(zhuǎn)miR-221對DC成熟的抑制作用。這些結(jié)果表明,myrothecine A能通過miR-221調(diào)控肝癌微環(huán)境中DC的成熟。而細(xì)胞因子如Arg-1、TGF-β、iNOS、IL-10、IP-10等可抑制免疫細(xì)胞的分化、成熟及功能,為探明miR-221抑制DC成熟的機(jī)制,我們將miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒感染Hepal-6后,收集細(xì)胞,提取mRNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測這些細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有IP-10的表達(dá)明顯增加,提示miR-221可能通過增加IP-10的表達(dá)抑制DC的成熟。綜上所述,myrothecine A一方面可以通過抑制miR-221的表達(dá),增加p27的蛋白水平,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。另一方面,myrothecine A也可以通過miR-221增加DC表面CD86和CD40分子的表達(dá),從而促進(jìn)肝癌微環(huán)境中DC的成熟發(fā)揮抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：Myrothecine A miR-221 肝癌細(xì)胞 增殖 DC 成熟
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號說明8-9
• 前言9-11
• 第一部分 Myrothecine A通過miR-221調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖11-28
• 1 材料11-14
• 2 方法14-18
• 3 結(jié)果18-26
• 4 討論26-28
• 第二部分 Myrothecine A通過miR-221調(diào)控肝癌細(xì)胞微環(huán)境中DC的成熟28-46
• 1 材料28-29
• 2 方法29-32
• 3 結(jié)果32-44
• 4 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 文獻(xiàn)綜述51-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 碩士期間發(fā)表論文60-61
• 致謝61-62

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本文編號：530164