本文關鍵詞：APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥BC-A1的抗腫瘤活性研究

  更多相關文章： APN抑制劑 抗腫瘤 侵襲 血管生成 凋亡

【摘要】：研究背景惡性腫瘤的致病因素多,發(fā)病機理復雜,這就造成了其治療的復雜性。目前惡性腫瘤的主要治療手段包括手術治療、化學治療和放射治療。傳統(tǒng)化學治療藥物都存在一定的毒副作用,長期使用容易產(chǎn)生耐藥性,限制了腫瘤的治療效果。氨肽酶N是M1家族的金屬蛋白酶,可以從蛋白質和多肽的氨基端降解中性氨基酸,從而參與炎癥反應和免疫應答、神經(jīng)肽和細胞因子的降解、抗原呈遞、信號轉導以及血管生成等。APN在多種腫瘤組織中過度表達,與腫瘤的生長、增殖、侵襲、轉移及腫瘤新生血管形成密切相關,抑制APN的過表達可以誘導腫瘤細胞凋亡。本課題組通過前期的計算機虛擬篩選和初步活性測定,獲得了吲哚-2,3-酮類化合物LJNK,該化合物不僅對豬腎微粒體APN表現(xiàn)出了良好的抑制作用和一定的選擇性,而且在體外對人腫瘤細胞具有較強的抗增殖作用。在本課題的第一部分中,我們從多個方面對LJNK的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了評價,對抗腫瘤作用機制進行了研究�；熕幬锛魉麨I在腫瘤的化學治療中起著重要作用。然而,體內(nèi)迅速代謝失活限制了吉西他濱的臨床應用。對吉西他濱N4位進行修飾和改造,可以減緩代謝失活,增加抗腫瘤活性,降低毒副作用。在實驗室前期工作中,以酰胺鍵將bestatin連接到吉西他濱N4位的氨基上,形成協(xié)同前藥BC-A1。初步活性研究證明了BC-A1在體外對APN酶具有良好的抑制活性。在本課題的第二部分中,我們從多個方面評價了化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性。第一部分吲哚-2,3-酮類APN抑制劑LJNK的抗癌活性研究本課題從以下方面對化合物LJNK抗腫瘤活性進行了研究：(1) LJNK與APN的相互作用：LJNK在和APN的分子對接實驗中,與酶的活性位點有效結合。用分光光度法測定了LJNK在體外對APN酶的抑制活性,實驗證明,LJNK競爭性結合APN,抑制作用優(yōu)于bestatirn。(2)體外抗血管生成活性:HUVEC二維管實驗和大鼠主動脈環(huán)實驗表明,LJNK和bestatin劑量依賴性的抑制腫瘤微血管形成,作用強于bestatin。(3)體外抗侵襲活性：transwell實驗表明,LJNK對腫瘤細胞ES-2侵襲具有抑制作用,抑制作用的強度稍弱于陽性對照bestatin。(4)體外抗增殖活性：MTT實驗和集落生成實驗都表明,LJNK對腫瘤細胞增殖具有抑制作用,作用強度強于bestatin。另外,非腫瘤細胞的MTT實驗結果表明,在有效抗腫瘤濃度下,LJNK對正常細胞的毒性作用非常弱。(5)體內(nèi)抗腫瘤增殖活性：通過昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,測定了LJNK在體內(nèi)對腫瘤的抑制作用。連續(xù)給藥兩周后,LJNK 80 mg/kg/d的腫瘤抑制率達到59.9%,并且實驗動物對LJNK有良好的耐受性。(6)初步機制探討：以流式細胞術和熒光拍照的方法檢測了LJNK對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。LJNK可以濃度依賴性的誘導腫瘤細胞凋亡,并且活性高于bestatin。進一步用免疫印跡和caspase酶活力測定的方法,證明了LJNK和bestatin誘導腫瘤細胞中cleaved caspase 3的表達水平上升,caspase 3活力增加�？傊�,LJNK能夠與APN有效結合,抑制APN酶活性,從而抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤細胞侵襲。LJNK能夠在體內(nèi)外抑制腫瘤增殖,誘導細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。LJNK誘導凋亡與caspase 3相關的凋亡通路有關。第二部分基于bestatin和吉西他濱的協(xié)同前藥BC-A1的抗癌活性研究本課題從以下方面對化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了研究：(1)APN酶抑制活性：用分光光度法測定BC-A1對APN酶的抑制活性。BC-A1和bestatin對豬腎微粒體APN酶抑制的1C50分別是12.11±2.17μM和4.59±0.43 μM。(2)體外抗血管生成作用：用HUVEC形成二維管實驗和大鼠主動脈環(huán)實驗測定了BC-A1對腫瘤組織新生血管形成的抑制作用,活性明顯高于陽性對照bestatin 。(3)體外抗侵襲活性：用transwell法測定了BC-A1對腫瘤細胞ES-2侵襲能力的影響。BC-A1作用于ES-2細胞,顯著抑制ES-2細胞的侵襲。(4)體外抗增殖活性：首先用MTT實驗和集落生成實驗檢測了BC-A1、吉西他濱、吉西他濱-bestatin(摩爾比1：1)、吉西他濱-bestatin (1:10)對腫瘤細胞的增殖抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn),增加bestatin的濃度并不能顯著增強抗增殖活性。多株腫瘤細胞的MTT實驗證明,BC-Al對腫瘤的增殖抑制作用與吉西他濱相當。(5)體內(nèi)抗增殖活性：通過昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,測定了BC-A1的體內(nèi)抗腫瘤作用�？诜o藥低劑量BC-A1對腫瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制作用,與靜脈注射更高劑量吉西他濱取得了相當?shù)寞熜А?6)誘導凋亡活性：用流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),2μM的BC-A1作用于PLC/PRF/5細胞可以誘導腫瘤細胞凋亡。總之,BC-A1保留了對APN酶的抑制作用,抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤的侵襲,能夠在體內(nèi)外有效抑制腫瘤細胞增殖,誘導凋亡。BC-A1口服有效,改善了吉西他濱的給藥途徑,具有良好的開發(fā)前景。
【關鍵詞】：APN抑制劑 抗腫瘤 侵襲 血管生成 凋亡
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符號說明16-19
• 第一章 前言19-30
• 第一節(jié) 氨肽酶N19-22
• 1.1 氨肽酶N的結構19-21
• 1.2 氨肽酶N的生物學功能21
• 1.3 氨肽酶N與腫瘤的關系21-22
• 第二節(jié) 氨肽酶N抑制劑22-25
• 2.1 APN抑制劑的結構設計22-23
• 2.2 APN抑制劑的研究進展23-25
• 第三節(jié) APN靶向藥物25-30
• 3.1 以NGR為配體的APN靶向藥物25-27
• 3.2 以bestatin為配體的APN靶向藥物BC-A127-30
• 3.2.1 吉西他濱概述27-28
• 3.2.2 吉西他濱結構改造28-30
• 第二章 APN抑制劑LJNK的抗腫瘤活性評價及機制研究30-59
• 第一節(jié) 化合物LJNK的合成30-34
• 1.1 化合物的合成路線31
• 1.2 化合物的合成步驟31-33
• 1.3 實驗討論33-34
• 第二節(jié) APN抑制劑LJNK的抗腫瘤活性研究34-59
• 2.1 實驗材料34-39
• 2.1.1 細胞株34
• 2.1.2 實驗動物34
• 2.1.3 試劑34-35
• 2.1.4 試劑配制35-38
• 2.1.5 儀器設備38-39
• 2.2 試驗方法39-46
• 2.2.1 LJNK與APN的分子對接39
• 2.2.2 人腫瘤細胞表面APN的表達39
• 2.2.3 APN酶活性測定39-40
• 2.2.4 HUVEC二維管形成實驗40-41
• 2.2.5 大鼠主動脈環(huán)實驗41
• 2.2.6 Transwell實驗41
• 2.2.7 MTT實驗41-42
• 2.2.8 集落生成實驗42-43
• 2.2.9 昆明鼠皮下荷H22腫瘤模型43
• 2.2.10 細胞凋亡測試43-44
• 2.2.11 Western blotting實驗44-45
• 2.2.12 Caspase活性測定45-46
• 2.2.13 數(shù)據(jù)處理46
• 2.3 實驗結果46-56
• 2.3.1 分子對接結果46-47
• 2.3.2 LJNK對APN酶的抑制作用47-49
• 2.3.3 LJNK抑制血管生成作用49-51
• 2.3.4 LJNK抗侵襲作用51
• 2.3.5 LJNK體內(nèi)外抗增殖活性51-53
• 2.3.6 LJNK毒性測試53-54
• 2.3.7 誘導腫瘤細胞凋亡測試54-56
• 2.4 討論與結論56-59
• 第三章 BC-A1協(xié)同前藥抗腫瘤活性評價59-67
• 1.1 實驗材料59-60
• 1.1.1 細胞株59-60
• 1.1.2 實驗動物60
• 1.1.3 試劑60
• 1.1.4 試劑配制60
• 1.1.5 儀器設備60
• 1.2 實驗方法60-62
• 1.2.0 APN酶活性測定60-61
• 1.2.1 HUVEC二維管形成實驗61
• 1.2.2 大鼠主動脈環(huán)實驗61
• 1.2.3 抗侵襲作用61
• 1.2.4 MTT實驗61
• 1.2.5 集落生成實驗61
• 1.2.6 昆明鼠皮下荷H22腫瘤模型61-62
• 1.2.7 細胞凋亡測試62
• 1.2.8 數(shù)據(jù)處理62
• 1.3 實驗結果62-66
• 1.3.1 BC-A1對APN酶的抑制作用62
• 1.3.2 BC-A1抑制血管生成作用62-63
• 1.3.3 BC-A1抗侵襲作用63
• 1.3.4 BC-A1體內(nèi)外抗增殖活性63-65
• 1.3.5 BC-A1誘導腫瘤細胞凋亡活性65-66
• 1.4 討論與結論66-67
• 總結與展望67-68
• 參考文獻68-74
• 致謝74-75
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文75-76
• 部分化合物~1H-NMR,~(13)C-NMR,HRMS圖譜76-82
• 學位論文評閱及答辯情況表82

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