本文關(guān)鍵詞：唑類藥物與氟西汀聯(lián)合應(yīng)用通過減弱毒力因子逆轉(zhuǎn)白色念珠菌耐藥性的作用與機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：近年來,由于廣譜抗生素、抗腫瘤藥物的大范圍應(yīng)用,放射治療和移植手術(shù)過程中的免疫抑制,免疫缺陷疾病患者尤其是艾滋病患者年增加等原因,白色念珠菌感染發(fā)生率不斷提高。以氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑?yàn)榇淼娜蝾愃幬锸桥R床應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥。近年來,白色念珠菌對(duì)唑類耐藥菌株的發(fā)生率不斷升高,因此臨床上迫切需要新的有效的治療方案。將效果逐年下降的抗真菌藥物與已獲得上市的非抗真菌藥聯(lián)合使用,可以在減少抗真菌藥劑量的同時(shí)發(fā)揮增效、減毒的作用。選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)近年來被人們發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性,但目前針對(duì)SSRIs抗真菌活性的研究多集中在使用棋盤法簡(jiǎn)單測(cè)定MICs上,缺少動(dòng)態(tài)活性以及相關(guān)的體內(nèi)研究。而且,目前的研究都集中在對(duì)抗真菌作用的測(cè)定上,更進(jìn)一步深入的機(jī)制研究仍屬空白。若能透徹研究選擇性五羥色胺再攝取抑制劑與唑類藥物的協(xié)同抗菌機(jī)制,可以對(duì)抗真菌耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生重大的理論和現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。目的：本課題評(píng)價(jià)唑類藥物與氟西汀聯(lián)合對(duì)耐藥的念珠菌的體外靜態(tài)及動(dòng)態(tài)抗真菌作用,建立大蠟螟感染模型評(píng)價(jià)體內(nèi)抗真菌作用,并探索可能的協(xié)同作用機(jī)制。方法：選擇白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等11株耐藥念珠菌。參照CLSI M27-A3方法中的棋盤法測(cè)定最小抑菌濃度,以真菌生長(zhǎng)與對(duì)照孔相比80%抑制為判斷重點(diǎn),用生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)差值模型(AE)和分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)法(FICI)評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用的效果。對(duì)于聯(lián)合作用的動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià),在藥物干預(yù)后的0,12,24,36和48h使用XTT法測(cè)定各孔的OD值。用藥物作用時(shí)間為x-軸,OD值為y-軸繪制時(shí)間-殺菌曲線。最后,選擇氟西汀和氟康唑作為實(shí)驗(yàn)藥物,測(cè)定兩藥聯(lián)合對(duì)耐藥白色念珠菌的生物膜的作用,分別在0,4,8,12,24和48h測(cè)定生長(zhǎng)率。之后,本課題使用大蠟螟建立白色念珠菌感染模型,分別以生存率、體內(nèi)真菌清除率和組織病理切片三個(gè)方面評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用對(duì)白色念珠菌的體內(nèi)作用。藥物聯(lián)用協(xié)同抗真菌的機(jī)制研究包括：使用卵黃瓊脂培養(yǎng)基體外測(cè)定氟康唑濃度固定的情況下,氟西汀對(duì)白色念珠菌的胞外磷脂酶活性的影響：使用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定分泌型天冬氨酸蛋白酶編碼基因SAP1, SAP2, SAP3, SAP4在不同藥物干預(yù)后的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：氟西汀與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌的FICI值0.5,ΔE加和200%,表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同作用。對(duì)耐藥非白色念珠菌的FICI值在0.5-1.5之間,表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。時(shí)間-殺菌曲線法進(jìn)一步證實(shí)。在加入藥物后不同的時(shí)間點(diǎn),藥物聯(lián)用可明顯抑制真菌生長(zhǎng),并持續(xù)較長(zhǎng)的作用時(shí)間。這一結(jié)果與棋盤法實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。微量稀釋法發(fā)現(xiàn),氟康唑和氟西汀聯(lián)用在24小時(shí)內(nèi)(4,8,12h)對(duì)白色念珠菌生物膜表現(xiàn)出協(xié)同抗真菌作用,但作用弱于對(duì)抗浮游菌。該協(xié)同作用隨生物膜生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn),氟康唑與氟西汀聯(lián)用時(shí),大蠟螟的生存率高于對(duì)照組和氟康唑單用組的大蠟螟,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。當(dāng)氟康唑與氟西汀聯(lián)用后,24小時(shí)后大蠟螟體內(nèi)的真菌數(shù)僅為注射量的1/5。隨時(shí)間延長(zhǎng),藥物聯(lián)用組的真菌數(shù)雖有上升,仍顯著低于對(duì)照組和FLC單用組。另外,病理組織切片的染色標(biāo)本同樣可以看到,感染后使用氟西汀與氟康唑聯(lián)合干預(yù),可以抑制白色念珠菌在大蠟螟體內(nèi)形成菌絲,減輕組織破壞程度。對(duì)藥物聯(lián)用的協(xié)同作用機(jī)制研究中,分泌型天冬氨酸蛋白酶的編碼基因SAP1-SAP4均在加入FLC與FLUO后表達(dá)量顯著下降,其中,SAP4最為顯著,表達(dá)量是FLC單用組的1/8。另外,雖然白色念珠菌的細(xì)胞外磷脂酶活性似乎不受到低濃度FLUO的影響,但當(dāng)FLUO濃度上升至64μg/ml及以上時(shí),磷脂酶活性急劇下降,幾乎看不到抑菌圈。結(jié)論：唑類藥物與選擇性五羥色胺再攝取抑制劑氟西汀聯(lián)用在體內(nèi)和體外均對(duì)耐藥白色念珠菌表現(xiàn)出協(xié)同作用,并對(duì)白色念珠菌生物膜同樣有效。兩藥協(xié)同抗白色念珠菌的作用機(jī)制與減少分泌型天冬氨酸蛋白酶編碼基因SAP1,SAP2,SAP3,SAP4的表達(dá)和抑制白色念珠菌胞外磷脂酶活性有關(guān)。本課題的研究發(fā)現(xiàn)為抗真菌藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：耐藥白色念珠菌 藥物聯(lián)合 協(xié)同作用 選擇性五羥色胺再攝取抑制劑 毒力因子
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 符號(hào)說明12-13
• 前言13-17
• 第一章 三唑類抗真菌藥物與氟西汀對(duì)耐藥念珠菌的體外聯(lián)合作用17-29
• 1. 材料17-19
• 1.1 藥品與主要試劑17-18
• 1.2 藥品、培養(yǎng)基與其他主要試劑的配制18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)菌株篩選19
• 1.4 主要儀器19
• 2. 試驗(yàn)方法19-23
• 2.1 三唑類與氟西汀聯(lián)合抗念珠菌靜態(tài)作用測(cè)定19-21
• 2.2 藥物聯(lián)合動(dòng)態(tài)抗白色念珠菌活性測(cè)定21-22
• 2.3 藥物聯(lián)用抗白色念珠菌生物膜作用測(cè)定22-23
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果23-28
• 3.1 三唑類藥物與氟西汀聯(lián)合抗念珠菌的靜態(tài)作用23-26
• 3.2 時(shí)間-殺菌曲線法對(duì)體外動(dòng)態(tài)聯(lián)合抗白色念珠菌作用的測(cè)定結(jié)果26-27
• 3.3 氟康唑與氟西汀聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌生物膜的sMIC值27-28
• 4. 討論28
• 5. 結(jié)論28-29
• 第二章 氟康唑與氟西汀對(duì)耐藥白色念珠菌的體內(nèi)聯(lián)合作用29-42
• 1. 材料29-30
• 1.1 藥品與主要試劑29
• 1.2 藥品、培養(yǎng)基與其他主要試劑的配制29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)菌株篩選30
• 1.4 主要儀器30
• 2. 試驗(yàn)方法30-35
• 2.1 建立白色念珠菌感染的大蠟螟幼蟲模型30-31
• 2.2 氟康唑與氟西汀聯(lián)用對(duì)白色念珠菌感染大蠟螟的生存率的影響31-32
• 2.3 白色念珠菌感染大蠟螟的真菌清除率實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.4 白色念珠菌感染大蠟螟的組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)33-35
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果35-40
• 3.1 建立白色念珠菌感染的大蠟螟幼蟲模型35
• 3.2 氟西汀與氟康唑聯(lián)用對(duì)大蠟螟生存率的影響35-37
• 3.3 氟西汀與氟康唑聯(lián)用對(duì)大蠟螟體內(nèi)真菌清除率的作用37-38
• 3.4 氟西汀與氟康唑聯(lián)用對(duì)大蠟螟組織病理變化的影響38-40
• 4. 討論40-41
• 5. 結(jié)論41-42
• 第三章 氟康唑與氟西汀聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌毒力因子的影響42-52
• 1. 材料42-44
• 1.1 藥品與主要試劑42-43
• 1.2 藥品、培養(yǎng)基與其他主要試劑的配制43
• 1.3 實(shí)驗(yàn)菌株篩選43
• 1.4 主要儀器43-44
• 2. 試驗(yàn)方法44-49
• 2.1 FLC與FLUO聯(lián)用對(duì)SAP1-SAP4基因表達(dá)的影響44-48
• 2.2 胞外磷脂酶活性測(cè)定48-49
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果49-50
• 3.1 分泌型天冬氨酸蛋白酶編碼基因SAP1-SAP4的表達(dá)水平49-50
• 3.2 FLUO對(duì)白色念珠菌胞外磷脂酶活性的影響測(cè)定50
• 4. 討論50-51
• 5. 結(jié)論51-52
• 全文小結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 致謝58-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文59-60
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表60

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本文編號(hào)：504146