本文關(guān)鍵詞：多效生長因子蛋白（PTN）的制備及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：順鉑(DDP)作為一種抗腫瘤藥物在多種類的腫瘤細(xì)胞中都表現(xiàn)出優(yōu)良的治療效果,現(xiàn)已在臨床中應(yīng)用多年。但在使用過程中順鉑所呈現(xiàn)出的細(xì)胞耐藥性也成了醫(yī)學(xué)界需要攻克的一大難題。Pleitrophin(PTN)又名肝素結(jié)合生長因子,它與孕中期腎蛋白(Midkine)生物學(xué)功能及基因結(jié)構(gòu)相似,兩者組成了一個(gè)全新的蛋白家族,命名為肝素結(jié)合生長/分化家族。PTN是一種在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的分泌性蛋白,在某些腫瘤細(xì)胞中也表現(xiàn)出一定的抗細(xì)胞凋亡活性。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與順鉑耐藥性關(guān)聯(lián)的抗凋亡蛋白研究中并未見PTN蛋白。本課題從Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞的c DNA中克隆出PTN基因,并將其克隆到Ptracer-EF/V5-His質(zhì)粒中,將該真核載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),得到外源表達(dá)的PTN蛋白,根據(jù)PTN蛋白的促細(xì)胞生長功能判斷其具有生物學(xué)活性,并將其純化備用。在濃度梯度順鉑作用的PC3細(xì)胞中,加入外源表達(dá)的PTN蛋白,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PTN刺激順鉑處理的PC3細(xì)胞后其IC50值較未加PTN組有明顯升高,說明PTN蛋白在順鉑作用細(xì)胞過程中起到抗凋亡的作用,降低了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性;利用不同濃度的PTN蛋白刺激順鉑處理的PC3細(xì)胞的流式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的抗凋亡作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。為了進(jìn)一步探究PTN蛋白對(duì)順鉑敏感性的影響,本研究利用sh-PTN干擾載體沉默PTN蛋白在PC3細(xì)胞中的表達(dá),檢查細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性及細(xì)胞的凋亡情況。將sh-Scramble、sh-PTN-1、sh-PTN-2轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞24h后,比較兩種sh-RNA的干擾效率在m RNA及蛋白水平的表達(dá)哪種更為明顯,瓊脂糖電泳及western結(jié)果顯示sh-PTN-2的干擾效率更佳。在PTN下調(diào)的PC3細(xì)胞中與正常PC3細(xì)胞對(duì)比,順鉑對(duì)其作用的IC50值有明顯的降低,即提高了順鉑的敏感性;隨后的流式實(shí)驗(yàn)中證明,轉(zhuǎn)染了sh-Scramble質(zhì)粒的PC3細(xì)胞組與Control組相比,加入順鉑后的細(xì)胞凋亡情況并未有太大變化,而在轉(zhuǎn)染了sh-PTN-2質(zhì)粒的PC3細(xì)胞中,順鉑誘導(dǎo)該組細(xì)胞的凋亡率較前兩組有一定幅度的增加,這也證明了PTN的沉默提高了PC3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。同時(shí)western blot實(shí)驗(yàn)證明在PTN沉默的PC3細(xì)胞中,加入順鉑后其C-PARP蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高,作為又一驗(yàn)證PTN調(diào)節(jié)順鉑敏感性的指標(biāo)。綜上所述,PTN可能是一種潛在的與順鉑敏感性相關(guān)的抗凋亡蛋白,為順鉑耐藥性的研究提供了研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：多效生長因子 順鉑 前列腺癌細(xì)胞 敏感性 蛋白制備
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 引言11-21
• 1.1 順鉑概述11
• 1.2 鉑類化療藥物的概述11-13
• 1.2.1 順鉑12
• 1.2.2 卡鉑12
• 1.2.3 奧沙利鉑12-13
• 1.3 順鉑的藥物作用機(jī)制13
• 1.4 順鉑耐藥性的因素13-16
• 1.4.1 DNA自我損傷修復(fù)13-15
• 1.4.4 抗凋亡蛋白與腫瘤抑制蛋白15-16
• 1.5 PTN基因的發(fā)現(xiàn)16
• 1.6 PTN的基因結(jié)構(gòu)與蛋白表達(dá)16-17
• 1.7 PTN的生物學(xué)功能17-19
• 1.7.1 促有絲分裂作用17
• 1.7.2 促血管形成作用17-18
• 1.7.3 促進(jìn)細(xì)胞軸突的生長活性18
• 1.7.4 參與骨、腎、肺和牙齒的發(fā)育過程18-19
• 1.7.5 與癌相關(guān)活性19
• 1.7.6 抗凋亡活性19
• 1.8 立題依據(jù)19-21
• 第2章 材料和方法21-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 細(xì)胞株21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器21-22
• 2.1.3 主要試劑與材料22-23
• 2.1.4 菌株與質(zhì)粒23
• 2.1.5 引物及shRNA23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-36
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建24-27
• 2.2.3 外源PTN蛋白的表達(dá)27-29
• 2.2.4 純化外源PTN蛋白29-30
• 2.2.5 外源PTN蛋白促細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.6 PTN蛋白刺激對(duì)PC3細(xì)胞順鉑敏感性的影響31
• 2.2.7 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的PTN蛋白對(duì)順鉑處理的PC3細(xì)胞凋亡率的影響31-32
• 2.2.8 PTN-shRNA對(duì)PTNmRNA及蛋白水平的影響32-34
• 2.2.9 檢查PTN沉默的PC3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性34
• 2.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制PTN表達(dá)后順鉑對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響34-35
• 2.2.11 檢查順鉑作用PTN沉默的PC3細(xì)胞中C-PARP的表達(dá)35-36
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-48
• 3.1 PTN表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定36-37
• 3.1.1 在Bxpc-3 細(xì)胞中獲得PTN基因片段36
• 3.1.2 構(gòu)建pTracer-EF/V5-His-PTN質(zhì)粒并酶切鑒定36-37
• 3.2 外源PTN蛋白的表達(dá)37-39
• 3.2.1 轉(zhuǎn)染條件的摸索37-38
• 3.2.2 檢查外源PTN在 293T細(xì)胞中的表達(dá)38-39
• 3.2.3 檢查外源PTN蛋白表達(dá)最佳時(shí)間點(diǎn)39
• 3.3 PTN外源蛋白的純化39-40
• 3.4 外源PTN蛋白的促細(xì)胞生長活性檢測40
• 3.5 PTN蛋白降低了PC3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性40-41
• 3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的PTN對(duì)細(xì)胞凋亡的影響41-42
• 3.7 抑制PC3細(xì)胞中PTN的表達(dá)42-45
• 3.7.1 PTN-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞42-43
• 3.7.2 檢查PTN RNA水平的沉默43-44
• 3.7.3 檢查PTN蛋白水平的沉默44-45
• 3.8 沉默PTN的PC3細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增強(qiáng)45-46
• 3.9 流式細(xì)胞術(shù)檢查順鉑對(duì)PTN沉默的PC3細(xì)胞凋亡的影響46-47
• 3.10 western blot檢查Cleaved-PARP47-48
• 第4章 討論48-51
• 第5章 結(jié)論51-52
• 作者及科研成果介紹52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59

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  本文關(guān)鍵詞：多效生長因子蛋白（PTN）的制備及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：489414