本文關(guān)鍵詞：以CVB3-3C為靶點的藥物篩選和結(jié)晶學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,病毒性心肌炎嚴(yán)重危害人類健康,抗病毒性心肌炎藥物的設(shè)計和篩選對治療該病尤為重要。B3型柯薩奇病毒(CVB3)是引起人類病毒性心肌炎最主要的病原體,其基因組只有一個開放閱讀框,編碼形成4個病毒衣殼蛋白(VP1-VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A-2C、3A-3D)。其中3C蛋白是柯薩奇病毒的一種自身水解蛋白酶,主要負(fù)責(zé)對大多數(shù)前體蛋白進(jìn)行剪切,形成成熟蛋白,同時它對病毒RNA的復(fù)制,蛋白引物的形成也至關(guān)重要,對病毒的繁殖擴(kuò)增極其重要,被認(rèn)為是抗病毒藥物設(shè)計的一個重要靶點。本論文首先使用原核表達(dá)體系實現(xiàn)CVB3-3C蛋白酶體外重組表達(dá),依次經(jīng)Ni-NTA親和層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析,獲得高純度CVB3-3C蛋白。為了實現(xiàn)針對CVB3-3C蛋白的藥物篩選,我們通過優(yōu)化實驗確定了CVB3-3C蛋白藥物篩選所需的緩沖液的類型、鹽離子濃度及pH,并對體系中蛋白酶濃度、底物濃度及CVB3-3C蛋白酶對DMSO耐受濃度進(jìn)行了優(yōu)化；同時,進(jìn)一步對體系的穩(wěn)定性、可靠性進(jìn)行分析評價,建立起一套完整的CVB3-3C蛋白藥物篩選體系。利用該體系對2000多種化合物進(jìn)行了篩選,共得到12種抑制率超過80%的化合物。其中6種化合物抑制效果較好,分別為：MDCE-10aIC50為36.70 μmol/L, MDCE-10c IC50為33.25μmol/L, MDCE-10e IC50為21.07 μmol/L, MDCE-A008 IC50為60.60 μmol/L, MDCE-A022 IC50為23.55 μmol/L, MDCE-A043 IC50為105.70μmol/L。用篩選得到的化合物與CVB3-3C蛋白酶進(jìn)行共晶實驗和藥物浸泡實驗,獲得CVB3-3C蛋白酶與抑制劑的復(fù)合物晶體。利用X-衍射技術(shù)對復(fù)合物晶體進(jìn)行分析,獲得了CVB3-3C蛋白酶與化合物MDCE-A008的復(fù)合物晶體,分辨率為2.4 A。本論文在分子水平上建立起以CVB3-3C為靶點的藥物篩選體系,并應(yīng)用該體系篩選有效抑制劑,作為抗CVB3藥物的目標(biāo)化合物。同時,利用蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)獲得CVB3-3C蛋白酶與抑制劑的復(fù)合物晶體,為復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析以及CVB3藥物目標(biāo)化合物的改良提供數(shù)據(jù)支持。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒 病毒性心肌炎 藥物篩選 抑制劑 結(jié)晶
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R94
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 主要符號表8-9
• 1 前言9-19
• 1.1 柯薩奇病毒與病毒性心肌炎9-12
• 1.1.1 柯薩奇病毒心肌炎的發(fā)病機(jī)制9-10
• 1.1.2 柯薩奇病毒心肌炎的診斷方法10-11
• 1.1.3 柯薩奇病毒心肌炎的治療方法11-12
• 1.2 B3型柯薩奇病毒的3C蛋白及其他蛋白12-15
• 1.2.1 柯薩奇病毒基因組結(jié)構(gòu)特征12
• 1.2.2 CVB3-3C蛋白的結(jié)構(gòu)研究12-14
• 1.2.3 CVB3-3C蛋白酶的功能研究14
• 1.2.4 B3型柯薩奇病毒的其他蛋白14-15
• 1.3 針對CVB3-3C蛋白酶的藥物研究15-17
• 1.3.1 以3C蛋白酶為靶點的藥物研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3.2 以3C蛋白酶為靶點的藥物篩選16-17
• 1.3.3 3C蛋白的結(jié)晶17
• 1.4 研究的內(nèi)容、目的及意義17-19
• 1.4.1 研究內(nèi)容17
• 1.4.2 研究目的及意義17-19
• 2 材料與方法19-39
• 2.1 實驗材料19-20
• 2.1.1 菌株、基因及載體19
• 2.1.2 實驗試劑19-20
• 2.1.3 實驗儀器和設(shè)備20
• 2.2 實驗方法20-39
• 2.2.1 培養(yǎng)基及緩沖液配制20-23
• 2.2.2 CVB3-3C蛋白酶的理化性質(zhì)分析23
• 2.2.3 CVB3-3C體外重組體系的構(gòu)建23-28
• 2.2.4 CVB3-3C蛋白的表達(dá)與純化28-30
• 2.2.5 基于CVB-3C蛋白酶藥物篩選體系的建立及應(yīng)用30-36
• 2.2.6 CVB3-3C與抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究36-39
• 3 實驗結(jié)果與討論39-59
• 3.1 CVB3-3C蛋白的基本信息39-40
• 3.1.1 CVB3-3C蛋白的基因序列和氨基酸序列39
• 3.1.2 CVB3-3C蛋白的理化信息39-40
• 3.2 CVB3-3C體外重組體系的構(gòu)建40-42
• 3.2.1 目的基因擴(kuò)增和載體的制備40-41
• 3.2.2 重組質(zhì)粒鑒定41-42
• 3.3 CVB3-3C蛋白的表達(dá)結(jié)果42-45
• 3.3.1 CVB3-3C蛋白的試表達(dá)結(jié)果42
• 3.3.2 CVB3-3C蛋白的親和層析結(jié)果42-43
• 3.3.3 CVB3-3C蛋白的陰離子交換層析結(jié)果43-44
• 3.3.4 CVB3-3C蛋白的分子排阻層析結(jié)果44-45
• 3.4 篩藥體系的建立45-53
• 3.4.1 CVB3-3C蛋白酶活性測定45-46
• 3.4.2 酶活緩沖液對CVB3-3C蛋白酶活性的影響46-49
• 3.4.3 DMSO對CVB3-3C蛋白酶活性的影響49-50
• 3.4.4 蛋白酶及底物濃度的確定50-52
• 3.4.5 藥物篩選體系的評價52-53
• 3.5 CVB3-3C蛋白酶抑制劑的篩選53-55
• 3.6 CVB3-3C與抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究55-59
• 3.6.1 CVB3-3C蛋白的結(jié)晶56
• 3.6.2 CVB3-3C與抑制劑的復(fù)合物晶體56-59
• 4 結(jié)論59-60
• 5 展望60-61
• 6 參考文獻(xiàn)61-69
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況69-70
• 8 致謝70

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5 喻昕;鄭t

本文編號：449912