α-酮纈氨酸（KIV）是生物合成中的重要中間體,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和化學(xué)合成等行業(yè)。目前,KIV可通過化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法合成�；瘜W(xué)法合成KIV步驟多,且需要苛刻的生產(chǎn)條件。微生物發(fā)酵法存在發(fā)酵周期長、產(chǎn)量低等缺點。相比而言,酶轉(zhuǎn)化法具有底物轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高、產(chǎn)物易分離、環(huán)境污染小等優(yōu)點,適合KIV的生產(chǎn)。本研究以大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）為宿主,對來源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶（PmLAAD）進(jìn)行異源表達(dá),從而構(gòu)建了重組菌株E.coli BL21（pET-28a-Pm LAAD）,利用該酶催化底物L(fēng)-纈氨酸（L-Val）合成產(chǎn)物KIV,并利用蛋白質(zhì)工程改造、菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化、全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化以及罐上轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等手段進(jìn)一步提高了L-氨基酸脫氨酶合成KIV的效率,論文主要內(nèi)容如下:（1）成功構(gòu)建了含有L-氨基酸脫氨酶基因的重組大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a-PmLAAD）,該基因來源于P.mirabilis。利用重組菌株催化底物L(fēng)-Val制備KIV,評估結(jié)果表明,當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^20 g·...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2海因法合成α-酮纈氨酸

化學(xué)合成法生產(chǎn)α-酮酸最為常用,它又可具體細(xì)分為:�；杌锼夥�,氧化法,格氏試劑法,海因法等[7]。在這些化學(xué)合成法中,KIV生產(chǎn)最常用的化學(xué)合成法是格氏試劑法和海因法。格氏試劑法是以草酸二乙酯和格氏試劑為反應(yīng)起始化合物,且反應(yīng)需在乙醚中進(jìn)行。該反應(yīng)步驟少,產(chǎn)品得率高。但是需....

圖1-3具有脫氨或者轉(zhuǎn)氨功能的四種酶

與前兩種生產(chǎn)方法相比,酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)KIV是一種綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)方式。這種生產(chǎn)方式一般具有底物單一,底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度高,反應(yīng)時間較短,反應(yīng)步驟較少等優(yōu)點。因此,酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)化學(xué)品在近年來獲得了廣泛的關(guān)注和發(fā)展。酶轉(zhuǎn)化法是以L-Val為底物,通過脫氨基作用或者轉(zhuǎn)氨基作用制備....

圖3-1 Pm LAAD經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE圖

為了驗證構(gòu)建的L-氨基酸脫氨酶基因重組菌是否在大腸桿菌中成功表達(dá)了LAAD,對該菌株進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。將重組菌pET-28a-PmLAAD在LB中進(jìn)行過夜培養(yǎng)后,以2%的接種量轉(zhuǎn)接入TB培養(yǎng)基中,在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6,添加0.4mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)1....

圖3-2底物濃度對制備KIV的影響

為了考察L-氨基酸脫氨酶重組菌pET-28a-PmLAAD催化L-Val制備KIV的能力,在25oC,pH8.0和10g·L-1全細(xì)胞催化劑的條件下,研究了不同底物濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖3-2所示,當(dāng)?shù)孜餄舛葟?0g·L-1增加至60g·L-1時,KIV的產(chǎn)量從....

本文編號：4041415