胰腺癌是一種高度惡性的消化系腫瘤,其臨床表現(xiàn)隱匿,發(fā)展迅速,預(yù)后極差,成為腫瘤病學(xué)的一大挑戰(zhàn)。目前胰腺癌的臨床發(fā)現(xiàn)和診斷基本上是依賴組織成像學(xué)及細(xì)胞檢測(cè)方法,難以實(shí)現(xiàn)早期診斷。在此背景下,細(xì)胞適配體因其高親和力和高選擇性等眾多優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注,CELL-SELEX技術(shù)也因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)得到了快速的發(fā)展,為解決上述問(wèn)題提供了一種新思路。本工作基于CELL-SELEX技術(shù),以人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1為靶細(xì)胞,以人肺腺癌細(xì)胞A549為對(duì)照細(xì)胞,開(kāi)展能特異性識(shí)別PANC-1的核酸適配體的篩選工作。主要研究?jī)?nèi)容包括:1.對(duì)篩選中涉及的PCR問(wèn)題進(jìn)行詳細(xì)的探討。本研究主要通過(guò)循環(huán)數(shù)的調(diào)整來(lái)獲得高效且特異性的PCR結(jié)果。在篩選前部分都投入大量的模板進(jìn)行PCR以減少有效序列的遺失,并討論了不同的PCR情況對(duì)篩選的影響。2.對(duì)進(jìn)化文庫(kù)的制備與定量問(wèn)題進(jìn)行詳細(xì)的研究。在進(jìn)化文庫(kù)的制備中,針對(duì)雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程進(jìn)行了熒光監(jiān)控。在進(jìn)化文庫(kù)的脫鹽處理上,比較了乙醇沉淀法與除鹽干燥法的優(yōu)缺點(diǎn)。在進(jìn)化文庫(kù)的定量問(wèn)題上,針對(duì)羧基熒光素FAM熒光強(qiáng)度對(duì)p H的敏感性,分別采用了0.2M Na OH和1×BB為背景進(jìn)行定量... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

核酸適配體與靶分子結(jié)合原理示意圖

序 言 CELL-SELEX 基礎(chǔ)上 PANC-1 核酸適配體的篩選(1) 篩選所需的寡核苷酸文庫(kù)是通過(guò)化學(xué)方法合成，無(wú)需通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)，可大量快速在體外合成。(2) 靶標(biāo)范圍很廣泛，小到 ATP、病毒、金屬離子[23-25]、氨基酸[26-29]等小分子，大到酶、肽以及不同大小和功能的蛋白質(zhì)[30-31,81-83]等生物大分子，也可以是完整的細(xì)胞[32-37]、切片[59]等。(3) 相對(duì)于抗體有更高的親和性和穩(wěn)定性，蛋白容易失活，在構(gòu)建生物傳感器時(shí)其物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，和變性的適配體很容易復(fù)性。(4) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和修飾，如在其末端連接一些活性基團(tuán)。(5) 還有分子量小、體積小、無(wú)免疫原性[90,91]、組織滲透好等優(yōu)點(diǎn)正是由于核酸適配體優(yōu)異的性質(zhì)，引起了研究者的廣泛關(guān)注，核酸適配相關(guān)的研究也如火如荼。如圖 2 所示，自 1990 年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究者們通過(guò)修改 SELEX 方法，擴(kuò)大篩選靶標(biāo)范圍，SELEX 技術(shù)經(jīng)歷了里程碑式的發(fā)展。

文庫(kù)的構(gòu)建：利用 DNA 化學(xué)合成技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)核酸適配體文庫(kù)1013~1018條不同堿基的序列，序列組成包括一個(gè)中間序列可變的隨定的恒定區(qū)。隨機(jī)序列區(qū)一般包15~60個(gè)堿基之間，兩端特定序列區(qū)間，后者在 PCR 中作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。若使用 RNA 作為文庫(kù)，區(qū)加入噬菌體 T7 啟動(dòng)子，以使 RNA 文庫(kù)轉(zhuǎn)化成 DNA 文庫(kù)。文庫(kù)與靶分子的結(jié)合：將隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶細(xì)胞在合適的緩沖使靶細(xì)胞與結(jié)合能力強(qiáng)的序列形成“核酸-靶細(xì)胞”復(fù)合物。增加負(fù)篩選，即將篩選文庫(kù)和對(duì)照細(xì)胞孵育結(jié)合，收集未與對(duì)照細(xì)再將該上清液投入靶細(xì)胞中進(jìn)行孵育。反篩選的引入有利于將非特快速淘汰。分離：通過(guò)一些合適的分離方法，如傳統(tǒng)的親和層析、硝酸纖維膜，將與靶細(xì)胞結(jié)合能力強(qiáng)的寡核苷酸保留，而未結(jié)合的和結(jié)合弱寡離。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血清CA199 CA125 CA242癌胚抗原表達(dá)水平與胰腺癌的早期診斷和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性研究[J]. 馬學(xué)柱.  山西醫(yī)藥雜志. 2016(13)
[2]厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌有效性和安全性的Meta分析[J]. 謝錚錚,梁瑤,孫路路.  中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志. 2016(08)
[3]胰腺癌MRI研究進(jìn)展[J]. 徐生芳,郭順林,辛仲宏,楊梅,張艷利.  中國(guó)CT和MRI雜志. 2014(02)
[4]微小RNA與胰腺癌關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 胡應(yīng)霞,張海蓉.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào). 2014(04)
[5]SELEX法體外篩選胃癌細(xì)胞適配子方法的建立[J]. 李真真,韓躍武,劉玲玲,韓亞萍,路艷,王春霞.  生物技術(shù). 2009(03)

碩士論文
[1]核酸適配體納米粒柔性支架及其循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效捕獲[D]. 劉玲.蘇州大學(xué) 2016
[2]應(yīng)用CELL-SELEX篩選PANC-1細(xì)胞適配體技術(shù)研究[D]. 鮑立新.蘇州大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3523143