高速蓬勃發(fā)展的前沿基因療法迫切需求高效低毒的遞送平臺,因此可用于傳輸基因編輯工具的遞送載體成為當前研究的熱點。本文以開發(fā)用于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的非病毒載體為研究課題,構(gòu)建了 CRISPR All-In-One表達質(zhì)粒作為樣板基因編輯系統(tǒng)模型,制備了改性殼聚糖類材料,探討了以殼聚糖類材料作為非病毒類載體遞送CRISPR/Cas9基因編輯工具的可行性�；虔煼ㄊ且环N從遺傳物質(zhì)層面處理疑難重癥的新興治療策略。在基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基因治療中,可通過構(gòu)建共載sgRNA及Cas9蛋白的All-In-One表達質(zhì)粒實現(xiàn)對目標基因的靶向處理。眾多研究表明ApoE基因是一個極具發(fā)展?jié)摿Φ幕蛑委煱悬c,因此本研究通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了以其為靶標的CRISPR All-In-One表達質(zhì)粒作為完整基因編輯系統(tǒng)模型。測序結(jié)果確認重組基因編輯質(zhì)粒構(gòu)建成功,紫外分光光度計檢測結(jié)果證明提取質(zhì)粒濃度高、純度好。殼聚糖是一種天然帶正電的線性多聚物,具有基因負載能力強、生物相容性高、細胞毒性低、易于修飾改性等諸多優(yōu)點,作為非病毒類載體材料備受關(guān)注。但其水不溶性及低轉(zhuǎn)染效率使其應(yīng)用極大... 

【文章來源】：電子科技大學四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－２?Ｂｂｓｌ酶切位點示意圖??

常用試劑配置方法如表３－３所示：??表３－３常用試劑配置方法???ｉｔｍ?配置方法???ＮａＯＨ?Ｃ１５％，?ｗ／ｖ）?１０ｍＬｄｄＨ２Ｏ?中加?１．５?ｇＮａＯＨ??ＮａＣｌ?（１０％，?ｗ／ｖ）?１０?ｍＬ?ｄｄ?Ｈ２０?中加?１?ｇ?ＮａＣＩ??３．２實驗方法??３．２．１改性殼聚糖類材料ＴＭＣ的合成??本研宄制備的Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化殼聚糖ＣＴＭＣ）采取一步法進行制備，生要??參照ｓｉｅｖｅｌ等人［５３］ＳＤｕｎｇ等人［５４］發(fā)表的合成方法，合成路線見圖３－１，具體合成??步驟如下所示：??在１５０?ｍＬ圓底燒瓶中，加入１．０?ｇ已過篩殼聚糖粉末（＜５００?ｐｍ）、２．４?ｇ碘??化鉀及４０?ｍＬ?１－甲基－２－吡咯烷酮，置于６０°Ｃ恒溫油浴中避光攪拌至殼聚糖溶解??完全，溶液變成淡黃色，接著在攪拌下逐滴加入５．５?ｍＬ?ＮａＯＨ?（１５％，ｗ／ｖ）及６．０??ｍＬＣＨ３Ｉ，混合液繼續(xù)于６０°Ｃ避光攪拌。期間進行薄層色譜法點板（配合碘缸顯??色．）檢測反應(yīng)進度，反應(yīng)宗全終止反應(yīng)》??用１００ｍＬ乙醇沉淀得到產(chǎn)物ＴＭＩ?（Ｎ，Ｎ，Ｎ－三甲基化売聚糖碘化物），１０００??�。保保彪x心３?１］１丨１１后分離下鳥沉淀加入２〇１］１１＾他（＾１（１０％，評／￥＞，常溫攪拌２１１進??行離子交換。??所得溶液用１００?ｍＬ乙醇再次沉淀，離心混合物去除含過量ＮａＣｌ的上清液，??所得過濾產(chǎn)物再分別用乙醇、乙醚徹底洗滌，４０°Ｃ下真空千燥，將所得產(chǎn)物溶于５０??ｍＬｄｄＨ２０中透析３ｄ，真空冷凍千燥，最終所得海綿狀乳白色固體即為Ｎ，Ｎ，??Ｎ－Ｈ甲基化殼聚糖。??Ｈ〇?Ｈ〇?－＾Ａｃｈ，?ＨＯ??

ｉｓｈｅｒ?Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公旬），??以溴化鉀壓片法制樣。將殼聚糖（ＣＳ）、所制得的Ｓ甲基化殼聚糖（ＴＭＣ）以及??溴化鉀ＫＢｒ分別在研缽中充分研磨為極細粉末（粒度２００目），放入紅外干燥箱??烘炙１２?ｍｉｎ，�。茫蛹埃裕停酶鳎�？２?ｍｇ加入ＫＢｒ均勻混合壓片（ＫＢｒ與殼聚糖類??樣品的比例約１００：１），以測定波數(shù)４０００？４００?ｃｍ４區(qū)間進行掃描分析。??３．３結(jié)果與討論??３．３．１?ＴＭＣ?的１ＨＮＭＲ?結(jié)果??將ＴＭＣ溶解在Ｄ２０中，進行ｉＨ－ＮＭＲ分析，結(jié)果見圖３－２。??Ｉ??ｇ?Ｓ?ｏｐ?？?〇５?ｗ??＾?ｃｏｃｏｃｏｔｏｃｏｃｏｃｏｃｏｃｏ?ｃｏｃｏ?ｃｉｏｉｏｉｃｓｃｖｉｏｉｏｉｏｊｃｊｏｉ??Ｉ?Ｉ?ＩＩ?Ｓｌ＾?Ｓｌ＾??Ｄ２〇?－ＣＯＣＨｓ????ｃｈ２ｏｈ?ｎ（ｃｈ３）２?ｃｈ２ｏｈ??Ｎ（ＣＨ３）３?ｃｈ２ｏｈ?ｎｈ??ｃ＝ｏ??－Ｎ（ＣＨ３）２??ＣＨ｜＿??－ｎ（ｃｈ３）３?８?＝ｑ??Ｓｉｇｎａｌ?ｐｐｍ??ｉ?Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ａｃｅｔｙｌ?ｇｒｏｕｐ?２．１５??Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ?ｇｒｏｕｐ?３．０１??｜?Ｈ?ｏｆ?Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ?ｇｒｏｕｐ?３．２９??Ｈ?ｏｆ?Ｃ２．?Ｃｅ．?Ｃｓ．?Ｃ４．?Ｃ３?３．４－４．４??－ＯＣＨ３?ＨｏｆＣｌ??Ｉ?ｉ?Ｉ??１??＾５Ｘ）?４＾?３Ｂ?Ｊ〇?Ｚ５?２Ｘｉ?Ｓ?１０?０５??ｆ１?（ｐｐｍ）??圖３－２三甲基化殼聚糖（ＴＭＣ）的１ＨＮＭＲ圖??２２??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于環(huán)糊精構(gòu)建的基因載體進展[J]. 徐妮為,劉夢艷,洪詩斌,顏蔚,付繼芳,鄧維.  化學進展. 2014(Z1)
[2]季銨鹽殼聚糖納米熒光探針的制備及細胞滲入研究[J]. 劉璠娜,饒華新,張子勇.  功能材料. 2008(05)



本文編號：3397083