核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating proteins,RIPs）是廣泛存在于高等植物的一類(lèi)RNA N-糖苷酶,它能夠催化斷裂真核生物28S rRNA的特殊頸環(huán)結(jié)構(gòu)的N-C糖苷鍵,脫去一個(gè)腺嘌呤,從而破壞核糖體的結(jié)構(gòu),阻遏蛋白質(zhì)的生物合成。近年來(lái),利用核糖體失活蛋白構(gòu)造與抗癌藥物結(jié)合構(gòu)造的免疫毒素在治療癌癥方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。三角梅核糖體失活蛋白Bouganin最初從紅花三角梅（Bougainvillea spectabilis wild）中分離,為Ⅰ型核糖體失活蛋白,是目前所發(fā)現(xiàn)的毒性最低的一種RIPs。本實(shí)驗(yàn)室利用同源序列克隆法從廈門(mén)市紫葉三角梅中成功克隆Bouganin基因并進(jìn)行了原核表達(dá)等研究工作。但由于原核表達(dá)的蛋白多以包涵體的形式存在,純化困難,另外原核表達(dá)蛋白免疫制備的抗體效價(jià)不高。本研究克隆了三角梅核糖體失活蛋白基因Bouganin,然后以畢赤酵母（Pichia pastoris GS115）為表達(dá)菌株中,以pPIC9K為載體,構(gòu)建了GS115-pPIC9K-Bouganin酵母的體外表達(dá)系統(tǒng),然后對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,最后利用固相金屬離子親和... 

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圖１．１核糖體失活蛋白的類(lèi)型［１（）］??Ｆｉｌ．ｌ?Ｔｅｓ?ｏｆ?Ｒｉｏｏｍｅ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎ??

第一章緒論??得指出的是所有的ＲＩＰｓ都能夠失活真核細(xì)胞的核糖體，但是少數(shù)ＲＩＰｓ，??、痢疾桿菌外毒素、紫茉莉?qū)俚目共《具�能夠失活原核細(xì)胞的核糖體［１２］露的ｒＲＮＡ對(duì)ＲＩＰｓ的敏感性不如完整的核糖體，表明核糖體上的蛋白對(duì)??ＮＡ相互作用具有十分重要的作用［１３］。研究發(fā)現(xiàn)將蓖麻毒素ｒｉｃｉｎ?Ａ鏈作??乳動(dòng)物核糖體時(shí)，ｒｉｃｉｎＡ鏈會(huì)與核糖體上的Ｌ９，?ＬｌＯｅ蛋白相互作用［１４］；陸抗病毒蛋白ＰＡＰ作用于酵母核糖體時(shí)，會(huì)與其Ｌ３蛋白交聯(lián)＾�？喙�??白ＭＰＡ３０作用于２８Ｓ?ｒＲＮＡ?xí)r，需要依賴(lài)于Ｋ＋和ＮＨ４＋才能發(fā)揮活性［１６］。??Ｐｓ的Ｎ－糖苷酶活性作用底物除了哺乳動(dòng)物的２８Ｓ?ｒＲＮＡ還包括釀酒酵母??的?２６Ｓ?ｒＲＮＡ，水稻（〇７知?的?２５Ｓ?ｒＲＮＡ，??腸桿菌中的２３ＳｒＲＮＡ等??

將帶有質(zhì)粒ＰＰＩＣ９Ｋ的保存菌株ＤＨ５ｃｘ擴(kuò)增培養(yǎng)，使用Ｔａｋａｒａ質(zhì)粒小??提試劑盒，提取質(zhì)粒ＰＰＩＣ９Ｋ。用Ｎａｎｏ?ｄｒｏｐ?ＤＮＡ濃度測(cè)定儀測(cè)定ＤＮＡ濃度如??下圖３－２：??ｆＳａｍｐｌｅ?ＩＤ?｜Ｕｓｅｒ?ｎａｍｅ?｜Ｄａｔｅ?ａｎｄ?Ｔｉｍｅ?｜Ｎｕｃｌｅｉｃ?Ａｃｉｄ?Ｃｏｎｅ．?｜Ｕｎｉｔ???１?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?２８４６?１３３?４?ｎｇ／ｐｌ??２?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３０?３２?１１２?６?ｎｇ／ｐｌ??３?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３１?２９?１４６?８?ｎｇ／ｐｌ??４?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３２：３６?１３３?ｎｇ／ｐｌ??５?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３３４３?－８?９?ｎｇ／ｐｌ??６?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３５?０２?１３７?ｎｇ／ｐｌ??７?Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｏｒ?２０１６－６－２１?１７?３６?１６?１８９?９?ｎｇ／ｐｌ??圖３－２提取的ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒濃度??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２．?ＤＮＡ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｐＰＩＣ９Ｋ??３７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用[D]. 郭雨剛.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2012

碩士論文
[1]三角梅核糖體失活蛋白的基因克隆和表達(dá)研究[D]. 宋麗娜.廈門(mén)大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3336120