方法:本研究首先以HepG2和HepaRG兩種細(xì)胞作為研究對象,主要從酶學(xué)指標(biāo)、蛋白表達(dá)及尿素分泌水平進(jìn)行綜合評(píng)估,從而優(yōu)選出更合適的細(xì)胞構(gòu)建2D及3D聚球體模型。通過RT-PCR檢測手段研究2D及3D模型在基因?qū)用娴谋磉_(dá)差異,免疫熒光檢測及Westen blot技術(shù)研究2D/3D模型在蛋白層面的差異;在毒性實(shí)驗(yàn)方面,采用陰性藥物阿司匹林（Aspirin,ASP）和陽性藥物對乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）對兩個(gè)模型進(jìn)行初步驗(yàn)證,證明該模型可以預(yù)測藥物肝毒性;然后選用具有膽汁淤積風(fēng)險(xiǎn)的陽性藥曲格列酮（Troglitazone,TRO）、奈法唑酮（Nefazodone,NEF）、托卡朋（Tolcapone,Tol）、異煙肼（Isoniazid,ISO）、氯丙嗪（Chlorpromazine,CPZ）、鹽酸氟西�。‵luoxetine hydrochride,FLX）、帕羅西�。≒aroxetine,PAR）、馬來酸三甲丙咪嗪（Trimipramine Maleate,TRM）、鹽酸度洛西汀（Duloxetine hydrochloride,DUX）以及陰性藥物葉酸（Fo... 

【文章來源】：聊城大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

HepG2 和 HepaRG 細(xì)胞形態(tài)及直徑

2.3.2 HepG2 和 HepaRG 細(xì)胞 HE 染色實(shí)驗(yàn)HepG2 和 HepaRG 細(xì)胞在 2D 環(huán)境中均選擇對數(shù)生長階段的細(xì)胞進(jìn)行染色，3D條件下以連續(xù)培養(yǎng) 10 天和 14 天的 HepaRG 細(xì)胞作為研究對象，進(jìn)行 HE 染色，因?yàn)榇穗A段的 HepaRG 細(xì)胞已經(jīng)分化成熟。HE 染色結(jié)果見圖 2-2。2D 培養(yǎng)條件下，HepG2細(xì)胞呈獨(dú)立生長，HepaRG 細(xì)胞間接觸相對較好，明顯優(yōu)于 HepG2 細(xì)胞，這有利于細(xì)胞更充分的物質(zhì)交流及信息傳遞；另外，在 2D 培養(yǎng)中 HepG2 及 HepaRG 細(xì)胞均呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，且生長狀態(tài)良好，見圖 2-2A；3D 聚球體模型中，在第 10天，HepaRG 細(xì)胞間內(nèi)部結(jié)構(gòu)接觸較為致密，細(xì)胞生長有序，無明顯壞死和供能障礙；對于連續(xù)培養(yǎng) 14 天的 HepaRG 聚球體模型，內(nèi)部細(xì)胞出現(xiàn)水腫、核碎裂及缺氧等功能障礙，說明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長及細(xì)胞體積不斷增大細(xì)胞由于供氧嚴(yán)重不足及營養(yǎng)物質(zhì)傳遞不通暢已經(jīng)瀕臨崩解，這不利于細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)以及進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2-2B。因此，最終決定選用培養(yǎng) 10 天的細(xì)胞進(jìn)行藥物毒性檢測。A

聊城大學(xué)碩士學(xué)位論文HepaRG 細(xì)胞中白蛋白的分泌量約為 HepG2 細(xì)胞的 4.36 倍，由此可得出結(jié)論：無何種培養(yǎng)條件，HepaRG 細(xì)胞中 ALB 生成水平均明顯優(yōu)于 HepG2，是更理想的細(xì)模型，如圖 2-4(A)。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HepG2 和 HepaRG 兩種細(xì)胞中的 ALB 在 2D 及 3D養(yǎng)條件下均顯示出明顯表達(dá)，且 HepaRG 細(xì)胞中的 ALB 生成較 HepG2 上升明顯如圖 2-4 B；此外，通過 WB 條帶分析也可得出同樣的結(jié)論，且 3D 聚球體模型要于 2D 傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，如圖 2-4 C。綜上所述，就模型建立而言，HepG2 及 HepaRG 細(xì)胞中 ALB 合成能力在 3D養(yǎng)環(huán)境下明顯優(yōu)于 2D 傳統(tǒng)培養(yǎng)方式；另外，就細(xì)胞而言，相同培養(yǎng)條件下 HepR細(xì)胞中白蛋白的產(chǎn)量要明顯高于 HepG2 細(xì)胞。所以，HepaRG 是更合適的體外細(xì)模型系統(tǒng)。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3297463