目的:從SFRP4/Wnt/β-catenin/Fox O3a/p27通路的角度,研究熊果酸（UA）對AngⅡ誘導(dǎo)A7r5細胞增殖的抑制作用。方法:復(fù)制SD大鼠高脂血癥模型,免疫組化技術(shù)檢測其胸主動脈壁SFRP4的蛋白表達;復(fù)制AngⅡ（0.1μM）誘導(dǎo)的A7r5細胞增殖模型,實驗分組為:正常對照組,AngⅡ模型組,UA組（5μM,10μM,20μM）,UA組均預(yù)給藥12h后加入AngⅡ造模24h,CCK-8法檢測該時間點細胞增殖活性;RT-PCR和western blot技術(shù)檢測各組細胞SFRP4、β-catenin、Fox O3a、p27的m RNA和蛋白水平;免疫熒光技術(shù)觀測β-catenin的胞內(nèi)定位;首次應(yīng)用RNA干擾技術(shù),驗證A7r5細胞通路級聯(lián)關(guān)系及UA的作用靶標,設(shè)計分組:AngⅡ模型組、模型+si-SFRP4組、模型+Wnt通路抑制劑XAV939（5μM,預(yù)孵育4h）組、UA組（20μM）、UA+si-SFRP4組、UA+Wnt通路激活劑Li Cl（500μM,預(yù)孵育4h）組;Western blot技術(shù)檢測干擾效率和目的蛋白表達;采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
引言
第一章 實驗材料
    1.1 受試動物和受試細胞
    1.2 主要試劑和材料
    1.3 主要儀器與耗材
第二章 實驗方法
    2.1 動物模型的建立
    2.2 免疫組織化學(xué)技術(shù)
    2.3 細胞培養(yǎng)技術(shù)
        2.3.1 細胞的培養(yǎng)傳代
        2.3.2 細胞的凍存
        2.3.3 細胞的復(fù)蘇
    2.4 CCK-8 檢測技術(shù)
        2.4.1 復(fù)制AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細胞增殖模型
        2.4.2 測定熊果酸對AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細胞增殖的影響
        2.4.3 轉(zhuǎn)染si-SFRP4對模型組和給藥組細胞活力的影響
        2.4.4 Wnt通路抑制劑XAV939和激活劑LiCl的毒性檢測
    2.5 熒光定量PCR技術(shù)
        2.5.1 RNA的提取
        2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄
        2.5.3 RTFQ-PCR
    2.6 Western Blot 技術(shù)檢測蛋白表達
        2.6.1 細胞總蛋白的提取和濃度測定
        2.6.2 Western blotting具體步驟
        2.6.3 Western blot數(shù)據(jù)處理
    2.7 siRNA轉(zhuǎn)染A7r5細胞
        2.7.1 轉(zhuǎn)染效率的考察
        2.7.2 轉(zhuǎn)染后的蛋白檢測
    2.8 免疫熒光技術(shù)
    2.9 統(tǒng)計學(xué)方法
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 免疫組化結(jié)果
    3.2 CCK-8 檢測細胞活力
        3.2.1 AngⅡ造模濃度的篩選
        3.2.2 UA有效保護濃度的篩選
        3.2.3 轉(zhuǎn)染si-SFRP4對細胞增殖率的影響
        3.2.4 Wnt通路抑制劑、激活劑的細胞毒性檢測
    3.3 UA對通路中各分子的影響
        3.3.1 UA對AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細胞內(nèi)SFRP4的mRNA及蛋白表達的影響
        3.3.2 UA對AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細胞內(nèi)β-catenin的mRNA及蛋白表達的影響
        3.3.3 UA對AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細胞內(nèi)FoxO3a的mRNA及蛋白表達的影響183.3.4 UA對AngⅡ誘導(dǎo)的A7r5細胞內(nèi)p27的mRNA及蛋白表達的影響
    3.4 SFRP4/wnt/β-catenin/Foxo3a/p27信號通路的驗證
        3.4.1 Western Blot檢測siRNA-SFRP4的基因沉默效率
        3.4.2 Western Blot檢測si-SFRP4對模型組和UA組細胞中β-catenin蛋白表達水平的影響
        3.4.3 Wnt通路抑制劑XAV939對Foxo3a/p27的影響
        3.4.4 Wnt通路激動劑LiCl對Foxo3a/p27的影響
    3.5 免疫熒光結(jié)果
第四章 討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果
致謝



本文編號：3269468